三量体G蛋白質の分子間認識における修飾脂質の立体構造と機能相関

修饰脂质在三聚G蛋白分子间识别中的三维结构和功能关系

基本信息

批准号：
08260202
负责人：
深田吉孝
金额：
$ 1.15万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

交付申請書に記載の研究実施計画に沿って研究を進め、以下の知見を得た。1.三量体G蛋白質のγサブユニットには、現在までに10種類以上のサブタイプが報告されている。このうち、視細胞のG蛋白質トランスデューシン(Tα・Tβγ)のγサブユニットはC末端システイン残基がファルネシル化(C15H25)されているのに対し、他のG蛋白質γサブユニットの多くはゲラニルゲラニル化(C20H33)されている。本研究では、修飾イソプレノイドの鎖長がβγ複合体の機能に及ぼす影響を明らかにする目的で、本来ファルネシル化されるTβγを人工的にゲラニルゲラニル化することを試みた。その結果、ゲラニルゲラニル化γとファルネシル化γを約9:1の割合で含む変異Tβγを作成することに成功した。そこでまず、得られた変異Tβγとファルネシル化Tβγの視細胞外節膜に対する親和性を比較したところ、前者の方が後者よりも外節膜に対して高い親和性を示すことが判明した。次に、Tα-Tβγ間の相互作用に及ぼす修飾イソプレノイドの鎖長の効果を検討する目的で、TαのGTPγのS結合反応、および百日咳毒素によるTαのADPリボシル化反応を指標として、これら二種類のTβγの促進効果を比較した。その結果、いずれの反応においても変異Tβγはファルネシル化Tβγよりも高い促進能力を示すことが明かとなった。したがって、修飾イソプレノイドの鎖長の違いによってTβγ複合体の視細胞外節膜への結合の強さ」と「サブユニット間の相互作用の強さ」の両方が変化すると考えられた。2.藤吉好則教授(京大・理)との共同研究により、インタクトな修飾脂質をもつTα-Tβγの2次元結晶を脂質膜上に作成した。現在、まだ分解能は低いが、極低温電子顕微鏡による観察像からTα-Tβγのプロジェクションマップを計算している。今後、分解能の向上とともに、原子座標のフィッティングを行う。

本研究按照资助申请中所述的研究实施计划进行，并获得以下研究结果。 1.目前已报道三聚体G蛋白γ亚基的亚型超过10种。其中，光感受器G蛋白转导蛋白γ亚基（Tα/Tβγ）的C端半胱氨酸残基是法尼基化的（C15H25），而其他G蛋白γ亚基大多数是香叶基香叶基（C20H33）。在本研究中，我们尝试人工将通常被法呢基化的Tβγ人工香叶基香叶基化，以阐明修饰的类异戊二烯链长度对βγ复合物功能的影响。结果，他们成功创建了含有香叶基香叶基化γ和法呢基化γ的突变体Tβγ，其比例约为9:1。首先，我们比较了获得的突变型Tβγ和法尼基化Tβγ对光感受器外节膜的亲和力，发现前者对外节膜的亲和力高于后者。接下来，为了考察修饰类异戊二烯的链长对Tα-Tβγ之间相互作用的影响，我们以Tα的GTPγS结合反应和百日咳毒素诱导的Tα的ADP-核糖基化反应作为指标。比较了Tβγ的影响。结果表明，突变型Tβγ在所有反应中均表现出比法尼基化Tβγ更高的促进能力。因此，认为Tβγ复合体与感光体外节膜的结合强度以及亚基之间的相互作用的强度均根据修饰类异戊二烯的链长而变化。 2.通过与Yoshinori Fujiyoshi教授（京都大学理学部）的联合研究，我们在脂质膜上创建了具有完整修饰脂质的Tα-Tβγ二维晶体。目前，尽管分辨率仍然较低，但可以根据使用冷冻电子显微镜观察到的图像来计算Tα-Tβγ的投影图。未来我们会提高分辨率，拟合原子坐标。