発生工学を基礎とした骨格筋の形成機構とその異常の解析

基于发育工程的骨骼肌形成机制及其异常分析

基本信息

批准号：
08252214
负责人：
鍋島陽一
金额：
$ 2.56万
依托单位：
National Center of Neurology and Psychiatry
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

マウス129遺伝子ライブラリーよりラミニンα2遺伝子をクローニングし、相同組み換えベクターを作成し、E14細胞に電気穿孔法により導入し、相同組み換え細胞を同定し、ついでノックアウトマウスを分離した。ラミニンα2mRNA,蛋白の発現解析によりホモマウスはnull変異であることを確認した。さらに電顕により筋、及び末梢神経を観察し、ホモマウスでは基底膜が観察されず、ラミニンα2が基底膜の形成に必須であることを確認した。野性型、ヘテロ、ホモはメンデルの法則に従って生まれるが、生後14日ころよりホモマウスの成長が遅れるようになり、21日頃になるとよろめきやけいれん症状を伴う筋ジストロフィーを発症する。なお、ヘテロマウスは野性型と区別がつかない。そこでホモマウスの組織学的解析を筋肉、神経系を中心に行い、次の結果を得た。生後9日までの筋組織は野性型と変わらないようにみえるが、生後11日には変性筋細胞が認められ、ついで生後13日には中心核をもつ再生筋線維が観察されるようになる。マウスでは、ちょうど、この時期に最終的な成熟がおこり、速筋では親型のミオシン重鎖(MHC)アイソフォームであるMHCIIBへと変換が起こるが、ホモ変異個体ではIIBの発現が観察されず、基底膜の形成が速筋の成熟に重要であることが示された。一方、遅筋線維で発現するβ/slow MHCの発現が認められ、若いマウスの遅筋の成熟は基底膜の形成に影響されないようである。ホモマウスの中枢神経系がやや小さく、組織学的には小脳の顆粒細胞、プルキニエ細胞の移動に異常があり、野性型では存在しない位置(白質やpia materの外側など)に一部の顆粒細胞、プルキニエ細胞が観察された。また、ホモマウスでは隣り合う小葉間の癒着が認められ、さらに抗ミエリン塩基性蛋白抗体で染まる白質が細いことが確認された。

我们从小鼠129基因库中克隆了层粘连蛋白α2基因，构建同源重组载体，通过电穿孔将其导入E14细胞，鉴定同源重组细胞，然后分离出敲除小鼠。层粘连蛋白α2 mRNA和蛋白的表达分析证实纯合小鼠为无效突变。此外，我们使用电子显微镜观察肌肉和周围神经，发现纯合小鼠中没有观察到基底膜，证实层粘连蛋白α2对于基底膜形成至关重要。野生型、杂合子和纯合子小鼠的出生均符合孟德尔定律，但纯合子小鼠从出生后14天左右开始生长迟缓，到21天左右，出现肌肉萎缩症，出现步履蹒跚和抽搐的症状。请注意，杂合小鼠与野生型小鼠没有区别。因此，我们对纯合小鼠进行了组织学分析，重点关注肌肉和神经系统，并获得了以下结果。出生后9天的肌肉组织看起来与野生型相同，但在出生后第11天观察到退化的肌肉细胞，然后在出生后第13天观察到具有中央核的再生肌纤维。。在小鼠中，在此期间发生最终成熟，并且快速肌细胞转化为亲代肌球蛋白重链（MHC）同工型MHCIIB，但在纯合突变体中没有观察到IIB的表达，这表明基底膜的形成很重要。促进肌肉快速成熟。另一方面，观察到在慢肌纤维中表达的β/慢MHC的表达，这表明年轻小鼠的慢肌成熟不受基底膜形成的影响。纯合子小鼠的中枢神经系统稍小，组织学上观察到小脑中的颗粒细胞和浦肯野细胞的迁移异常。此外，在纯合子小鼠中观察到相邻小叶之间的粘附，并且发现用抗髓磷脂碱性蛋白抗体染色的白质更薄。