Conditional Targeting 法による生命機能の解明

使用条件靶向方法阐明生物学功能

基本信息

批准号：
07260217
负责人：
鍋島陽一
金额：
$ 1.92万
依托单位：
National Center of Neurology and Psychiatry
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07260217/
关键词：
相同組み換え Cre-リコンビネース LoxP 配列遺伝子ノックアウト

项目摘要

組織特異的に遺伝子機能を欠失させるシステムの開発を目的として実験を行い、次の結果を得た。1)標的遺伝子の目的配列を挟んでリコンビネースの認識配列であるloxPを2個もつターゲッテイングベクターを作り、相同組み替え細胞を作成した。この細胞にリコンビネース発現プラスミドをトランスフェクトし、TK遺伝子の欠失をマーカーとして細胞を選択したところ、大部分の細胞でloxPにかこまれた遺伝子が切り取られていることが確認された。現在、個体レベルでの検討を行っている。2)loxP配列を3個もつ相同組み換えベクターを構築し、相同組み換えES細胞をえた。この細胞にリコンビネースを発現させ、3種類の組み合わせでloxPに囲まれた配列が切り取られた細胞を分離することを試みたが、細胞を分離することができなかった。原因は特定できなかったがGANCを選択に利用することが問題と考え、GANCによる選択をせずに無作為に細胞クローンを選択し、PCRによって解析することにより、目的の細胞を得ることに成功した。3)トランスジェニックマウスを作成する過程で挿入突然変異により、早期老化を示す変異マウス系統を樹立することに成功した。遺伝形式は劣性でホモ個体のみが早期死亡、発育障害、老人性動脈硬化、骨密度の低下、神経細胞の脱落、性腺の萎縮、胸腺の萎縮、軟部組織の石灰化など、顕著な老化症状を呈する。一カ所に遺伝子が挿入されており、その領域に個体老化に関連する重要な遺伝子が存在していると推定され、現在、原因遺伝子のクローニングを行っている。

我们进行了实验来开发组织特异性基因功能删除系统，并获得了以下结果。 1）我们创建了一个带有两个loxP识别序列的靶向载体，用于重组夹着目标基因的所需序列，并创建了同源重组细胞。当用重组酶表达质粒转染这些细胞并使用TK基因的缺失作为标记来选择细胞时，证实了在大多数细胞中被loxP包围的基因被切除。目前，我们正在进行个人层面的调查。 2)构建含有3个loxP序列的同源重组载体，获得同源重组ES细胞。我们在这些细胞中表达重组酶，并尝试使用三种不同的组合来分离其中 loxP 周围序列被切除的细胞，但我们无法分离细胞。虽然无法确定原因，但我们认为问题在于使用GANC进行选择，并且通过随机选择不使用GANC的细胞克隆并通过PCR对其进行分析，我们成功地获得了所需的细胞。 3）在创建转基因小鼠的过程中，我们成功建立了通过插入突变表现出过早衰老的突变小鼠品系。遗传模式为隐性，只有纯合子个体才会出现明显的衰老症状，如早死、发育障碍、老年动脉硬化、骨密度下降、神经细胞丢失、性腺萎缩、胸腺萎缩、软组织钙化等。展示。在某个位置插入了基因，推测该区域存在与个体衰老相关的重要基因，目前正在克隆该致病基因。