プロテオリポソームを素構造とした結晶化薄膜の作製

具有脂蛋白体基本结构的结晶薄膜的制备

基本信息

批准号：
07241217
负责人：
高橋卓也
金额：
$ 1.22万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

素構造であるバクテリオロドプシン(bR)のプロテオリポソームを各種のアルキル鎖長を持つ脂質(DLPC,DMPC,DPPC,DSPC)を用いて作製した。具体的には、1)紫膜から界面活性剤を用いて再構成、または2)球殻状構造体からリポソームに融合して再構成を行った。作製したプロテオリポソームでプロトンポンプ活性を確認した。プロテオリポソーム上でのbRの構造を円二色性(CD)分散計及び透過型電子顕微鏡を用いて解析した。bR内のレチナ-ルに由来するCDスペクトルは脂質の種類に依存して温度相転移を示し、脂質の相転移温度が低いものほど蛋白質の会合が低温で生じるという結果が得られた。DMPCプロテオリポソーム試料を急速凍結して膜の割断面を電子顕微鏡により観察したところ、その会合体は3量体であり、分散して存在していることがわかった。相転移温度より低温では、DMPCプロテオリポソーム試料に高濃度の塩(〜4M、NaCl)を添加すると、膜内にbRの2次元結晶が観測され、CDスペクトルにも顕著な変化が見られた。その格子定数は約10nmで、以前報告された値より1割程度大きかった。DPPCプロテオリポソームでは、結晶化は起こらずCDスペクトルにも顕著な変化が見られなかった。相転移温度より十分高い温度では、構成脂質によらずNaCl濃度に依存してCDスペクトルの変化が見られた。bR球殻状構造体では、膜状に高度に配向したbRが密に存在し、そのCDスペクトルに弱い温度依存性が観測された。球殻状構造体には逆プロトンポンプ活性が存在し、その形状が非常にそろっている。それを素構造とし、水サブフェイズ法を用いてその2次元結晶を作製中である。

使用具有不同烷基链长度的脂质（DLPC、DMPC、DPPC 和 DSPC）制备具有基本结构的细菌视紫红质（bR）的蛋白脂质体。具体来说，我们进行了 1) 使用表面活性剂从紫色膜重构，或 2) 通过将球形壳状结构融合到脂质体中进行重构。证实了制备的蛋白脂质体的质子泵活性。使用圆二色性（CD）色散计和透射电子显微镜分析了蛋白脂质体上的bR结构。来自bR中视网膜的CD光谱显示出取决于脂质类型的温度相变，并且脂质的相变温度越低，发生的蛋白质缔合越低。当快速冷冻DMPC蛋白脂质体样品并使用电子显微镜观察膜的切割表面时，发现聚集体是三聚体并且以分散的方式存在。在低于相变温度的温度下，当向DMPC蛋白脂质体样品中添加高浓度的盐（~4 M，NaCl）时，在膜内观察到bR的二维晶体，并且CD中也观察到显着的变化光谱。其晶格常数约为10 nm，比之前报道的值大约10%。对于DPPC蛋白脂质体，没有发生结晶并且在CD光谱中没有观察到显着的变化。在比相变温度足够高的温度下，观察到圆二色光谱的变化取决于氯化钠浓度，而与脂质成分无关。在bR球壳结构中，高度取向的bR以膜状方式致密存在，并且在其CD光谱中观察到弱的温度依赖性。球壳状结构具有反质子泵活性，且形状非常均匀。以此为基本结构，我们目前正在使用水亚相法生产二维晶体。