Ca^<++>流入とカテコラミン分泌の急速脱感作の分子機構のリアルタイム同時測定による研究

实时同步测量研究Ca^++内流和儿茶酚胺分泌快速脱敏的分子机制

基本信息

批准号：
01659513
负责人：
加藤隆一
金额：
$ 0.96万
依托单位：
Keio University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1989
资助国家：
日本
起止时间：
1989 至 1990
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-01659513/
关键词：
脱感作細胞内カルシウム濃度カテコラミン分泌副腎髄質

项目摘要

各種刺激による神経伝達物質などの遊離には脱感作が起こることが知られているが、その機構には不明な点が多く、脱感作の機構を明らかにすることは刺激-分泌関連、特にその調節機構の解明に重要なことと考えられている。本研究では、培養牛副腎髄質クロマフィン細胞を用い灌流系においてCA分泌の測定と同時に細胞内遊離カルシウム濃度変化を経時的に測定する新しい方法を用い、脱感作の分子機構を明らかにすることを目的としている。(1)実験方法の確立:牛副腎髄質クロマフィン細胞は単離して、differential platingによる精製の後、minimum essential mediumに10%牛胎仔血清を補った培養液にMEM non-essential amino acids(x100)をlml/100ml加えた培養液中で、マイクロビ-ズと混合し、5-7日目に実験に用いた。この方法により細胞の剥離が最小限に抑えられた。さらに、試作品であるが、分解洗浄可能でデッドスペ-スが約70μlのセルが完成した。(2)本灌流系での各種刺激薬物の効果:培養牛副腎髄質クロマフィン細胞において、高カリウムまたニコチンのパルス刺激により340nm励起の蛍光強度の上昇と380nm励起の蛍光強度の減少、又その比の上昇が見られ、その反応に伴い急速なカテコラミン分泌が認められた。パルス刺激の場合には両刺激ともに細胞内遊離カルシウム濃度とカテコラミン分泌の増減はパラレルであった。一方、持続刺激の場合、ニコチンが灌流液中に存在するにもかかわらず、細胞内遊離カルシウム濃度とカテコラミン分泌の上昇は急速な脱感作(t1/2=60sec)を受けることが明らかになった。また、興味あることに高カリウム刺激の場合細胞内遊離カルシウム濃度は高いレベルを維持するが、カテコラミン分泌には急速な脱感作が生じた。この結果はニコチン刺激と高カリウム刺激とでは脱感作現象が異なること、さらに高カリウム刺激の場合、細胞内遊離カルシウム濃度上昇以後の過程がカテコラミン分泌の脱感作に関与していることが示唆された。

众所周知，当神经递质因各种刺激而释放时，就会发生脱敏，但其机制尚有许多未知之处，这对于阐明其调节机制尤为重要。在这项研究中，我们采用了一种新方法，在使用培养的牛肾上腺髓质嗜铬细胞的灌注系统中测量CA分泌的同时，测量细胞内游离钙浓度随时间的变化，以阐明脱敏的分子机制。 (1)实验方法的建立：通过差速平板分离纯化牛肾上腺髓质嗜铬细胞，然后加入补充有10%胎牛血清的MEM非必需氨基酸的最低必需培养基(x100)中混合。将微珠置于含有lml/100ml混合物的培养基中，并用于第5-7天的实验。该方法最大限度地减少了细胞脱离。此外，虽然是原型机，但已经完成了可拆卸清洗、死腔约70μl的单元。 (2)该灌注系统中各种刺激药物的作用：在培养的牛肾上腺髓质嗜铬细胞中，高钾或尼古丁脉冲刺激使340nm激发处的荧光强度增加，并降低380nm激发处的荧光强度，及其比例。观察到增加，并且与该反应一起观察到儿茶酚胺的快速分泌。在脉冲刺激的情况下，两种刺激的细胞内游离钙浓度和儿茶酚胺分泌的增加和减少是平行的。另一方面，在持续刺激的情况下，尽管灌注液中存在尼古丁，但细胞内游离钙浓度和儿茶酚胺分泌的增加会导致快速脱敏（t1/2=60秒）。有趣的是，高钾刺激维持了高水平的细胞内游离钙，但迅速使儿茶酚胺分泌脱敏。这些结果表明，尼古丁刺激和高钾刺激的脱敏现象不同，并且在高钾刺激的情况下，细胞内游离钙浓度增加后的过程参与了儿茶酚胺分泌的脱敏。。