車軸藻ミオシンの機能と構造の特異性と同一性

腋窝肌球蛋白的功能和结构特异性及特性

基本信息

批准号：
09279221
负责人：
藤目杉江
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

車軸藻ミオシンは脅威的な速さの滑り運動を呈する。このミオシンの構造及び力学的・生化学的特性を調べ、骨格筋ミオシンとの比較において同一性と特異性を明らかにする中で、滑り運動の機能発現の分子メカニズムの詳細を探ることを目的としている。車軸藻ミオシンのクローニングについては、ミオシン頭部共通配列をプライマーに用いたPCRから2種クローンを得た。それらはほたて貝ミオシンと72%、Dictyosteliumミオシンと56%の相同性を持つ。全長シーケンスを進める一方、何れが速いミオシンかを知るため、各々大腸菌発現系を作成したのでそれら蛋白質の抗体作成を行っている。アクトミオシンATP分解活性がその速さを説明するほど高いか否かの知見は重要である。精製車軸藻ミオシンのアクチン活性化ATPaseを今回測定したところでは13s^<-1>と骨格筋のそれと同程度であった。一方ミオシンのbasicなATPae活性はその中間体の寿命の長さを反映しているが、その寿命の長さが滑り速度と深く関わっていることを我々は見出し報告した。従って、車軸藻ミオシンのbasic ATPaseの知見は重要であるが、今回の測定では検出出来なかった。大量かつ高純度の車軸藻ミオシンが必要で今後の課題として残った。アクチンサブドメイン2にある40-50ループの切断は骨格筋ミシンによる滑り速度を大きく減少させる。ところが車軸藻ミシンでは全く減少しない。このループ切断は天然トロポミオシンにより機能回復することを見いだした。然し、車軸藻ミオシンではトロポミオシン結合アクチン線維は全く運動性を示さなかったことは既に報告た。このアクチン結合部位の特異性が車軸藻ミオシンの滑り速度の速さに繋がる事を示唆しており、力学・生化学的アプローチから今後検討して行きたい。

轴向藻类肌球蛋白表现出以威胁性速度的滑行运动。我们研究了这种肌球蛋白的结构、机械和生化特性，并在与骨骼肌肌球蛋白进行比较阐明其身份和特异性的同时，旨在探索滑动运动功能表达的分子机制的细节。关于腋窝肌球蛋白的克隆，使用共同的肌球蛋白头序列作为引物通过PCR获得两个克隆。它们与扇贝肌球蛋白具有 72% 的同源性，与盘基网柄菌肌球蛋白具有 56% 的同源性。在进行全长测序的同时，我们为每种蛋白质创建了大肠杆菌表达系统，以便找出哪种肌球蛋白最快，并且我们现在正在为这些蛋白质创建抗体。了解肌动球蛋白 ATP 降解活性是否足够高以解释其快速性非常重要。纯化的腋藻肌球蛋白中肌动蛋白激活的ATP酶在13s^-1时测量，这与骨骼肌中的相当。另一方面，肌球蛋白的基本ATPae活性反映了其中间体的寿命，我们发现并报道了其寿命与滑动速度密切相关。因此，了解腋藻肌球蛋白的基本ATP酶很重要，但在本次测量中无法检测到。需要大量、高纯度的腋藻肌球蛋白，这对未来来说仍然是一个挑战。肌动蛋白亚域 2 中 40-50 环的裂解显着降低了骨骼肌缝合速度。然而轴藻缝纫机却丝毫没有减少。我们发现这种环裂解可以通过天然原肌球蛋白恢复。然而，我们已经报道过，腋窝肌球蛋白中的原肌球蛋白结合的肌动蛋白纤维没有表现出运动性。这表明该肌动蛋白结合位点的特异性与腋窝肌球蛋白的高滑动速度有关，我们希望将来从机械和生化方法中对此进行研究。