Ca^<2+>/カルモジュリン依存性キナーゼ活性の可視化試薬の開発と応用

Ca^2+/钙调蛋白依赖性激酶活性可视化试剂的开发与应用

• 批准号: 09273249
• 负责人: 工藤 佳久
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Tokyo University of Pharmacy and Life Science
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09273249/
• 关键词: Ca^<2+>; カルモジュリン依存性キナーゼ; 可視化試薬; リン酸化; カルモジュリン; カルシウム; 蛍光

我々はすでに蛍光CaMKI可視化試薬(AS2)の創製に成功しているが、その安定性、感度、選択性をさらに高めることを目的として本研究を計画した。本年度は次の点について、研究の進捗があった。1)AS2の蛍光強度を高めるためAcrylodaneに代えてDACM(N-(7-Dimethy lamino-4-methyl-coumarinyl)-maleimide)を結合させた試薬(DS2)を合成した。この試薬は確かにAS2より強い蛍光を発したが若干毒性があり、AS2を大きく越える試薬とはならなかった。2)AS2の安定性を高めるためにN-末のLeucineをD-Leucineに置き換えたDLAS2を作った。この試薬は予想通り安定性が増し、細胞内での残存率が飛躍的に高まった。しかし、リン酸化反応がAS2に比べて遅くなっていた。従って、リン酸化の測度を正確に測定することは難しいものと思われるが、長時間の計測には有効と思われる。3)AS2にはCa活性化カルモデュリンとの結合による470nmの蛍光上昇が見られ、これがリン酸化測定の精度をやや鈍らせていた。そこで、Caおよびカルモデュリン存在下でAS2の470nmの蛍光が少ない試薬として、Syntide2の基礎となった基質、グリコーゲンシンターゼのCaMKIIによるリン酸化部位の部分ペプチドを参考として、C-末をLE(Leucine-glutamic acid)に置き換えた試薬にAcrylo daneを結合した試薬、LEAS2を創製したこの試薬についてはCa/カルモデュリンとの反応の際に470nmの蛍光はほとんど生じなかった。この試薬のリン酸化はAS2より遅く、また、リン酸化によって蛍光強度が減少した。4)さらに本年度はCaMKIIの自己リン酸化部位の部分ペプチドを参考として新しい試薬の作製に着手した。

尽管我们已经成功创建了荧光 CaMKI 可视化试剂 (AS2)，但我们计划这项研究的目的是进一步提高其稳定性、灵敏度和选择性。今年，研究取得以下几方面进展。 1）为了增加AS2的荧光强度，我们合成了一种试剂（DS2），其中附着DACM（N-（7-二甲基氨基-4-甲基-香豆素基）-马来酰亚胺）代替丙烯酰亚胺。虽然这款试剂确实发出了比AS2更强的荧光，但它有轻微的毒性，并没有成为明显超过AS2的试剂。 2）为了增加AS2的稳定性，我们创建了DLAS2，其中N端亮氨酸被D-亮氨酸取代。正如预期的那样，该试剂的稳定性提高了，并且其在细胞内的存活率显着提高。然而，磷酸化反应比AS2慢。因此，尽管精确测量磷酸化程度似乎很困难，但对于长期测量似乎是有效的。 3) AS2由于与Ca激活的钙调蛋白结合而在470 nm处表现出荧光增加，这在一定程度上降低了磷酸化测量的准确性。因此，作为在 Ca 和钙调蛋白存在下在 470 nm 处具有低 AS2 荧光的试剂，我们使用糖原合酶 CaMKII 磷酸化位点的部分肽（Syntide2 的基础）作为参考，并改变了 C-末端为LE（试剂中的丙烯酸丙烯酸酯替换为酸）。丹麦标记试剂 LEAS2 在与 Ca/钙调蛋白反应期间几乎不产生 470 nm 处的荧光。该试剂的磷酸化速度比AS2慢，并且荧光强度随着磷酸化而降低。 4) 此外，今年，我们开始以CaMKII自磷酸化位点的部分肽作为参考来创建新试剂。

项目成果

Tanaka,E., Yamamoto,S., Kudo,Y., Mihara,S.and Higashi,H.: "Mechanisms underlying the rapid depolarization produced by deprivation of oxygen and glucose in rat hippocampal CA1 neurons in vitro" J.Neurophysiol.78. 891-902 (1997)

Tanaka,E.、Yamamoto,S.、Kudo,Y.、Mihara,S. 和 Higashi,H.：“体外大鼠海马 CA1 神经元缺氧和葡萄糖产生快速去极化的机制”J.Neurophysiol。

Uchino,S., Kudo,Y., Watanabe,W., Nakajima-Iijima,S and Mishina,M.: "Inducible expression of N-methyl-D-aspartate(NMDA)receptyor channels from cloned cDNA in CHO cells" Mol.Brain Res. 44. 1-11 (1997)

Uchino,S.、Kudo,Y.、Watanabe,W.、Nakajima-Iijima,S 和 Mishina,M.：“CHO 细胞中克隆 cDNA 的 N-甲基-D-天冬氨酸 (NMDA) 受体通道的诱导表达”Mol

工藤 佳久、東 秀好: "生細胞におけるCa2+/CaMIIキナーゼの可視化解析" 細胞工学. 16. 64-69 (1997)

Yoshihisa Kudo、Hideyoshi Higashi：“活细胞中 Ca2+/CaMII 激酶的可视化分析”《细胞工程》16. 64-69 (1997)。

工藤佳久(共著): "バイオイメージング" 曽我部正博、臼倉治郎編集 共立出版, 266 (1998)

Yoshihisa Kudo（合著者）：“Bioimaging”Masahiro Sogabe、Jiro Usukura（编辑）Kyoritsu Shuppan，266（1998）

Higashi,H., Sato,K., Ohtake,A., Omori,A., Yoshisa,S.and Kudo,Y.: "Imaging of cAMP-dependent protein kinase activity in living neural cells using a novel fluorescent substrate" FEBS Letters. 414. 50-60 (1997)

Higashi,H.、Sato,K.、Ohtake,A.、Omori,A.、Yoshisa,S. 和 Kudo,Y.：“使用新型荧光底物对活神经细胞中 cAMP 依赖性蛋白激酶活性进行成像” FEBS