Ca^<2+>/カルモジュリン依存性キナーゼ活性の可視化試薬の開発と応用

Ca^2+/钙调蛋白依赖性激酶活性可视化试剂的开发与应用

• 批准号: 09273249
• 负责人: 工藤 佳久
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Tokyo University of Pharmacy and Life Science
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09273249/
• 关键词: Ca^<2+>; カルモジュリン依存性キナーゼ; 可視化試薬; リン酸化; カルモジュリン; カルシウム; 蛍光

我々はすでに蛍光CaMKI可視化試薬(AS2)の創製に成功しているが、その安定性、感度、選択性をさらに高めることを目的として本研究を計画した。本年度は次の点について、研究の進捗があった。1)AS2の蛍光強度を高めるためAcrylodaneに代えてDACM(N-(7-Dimethy lamino-4-methyl-coumarinyl)-maleimide)を結合させた試薬(DS2)を合成した。この試薬は確かにAS2より強い蛍光を発したが若干毒性があり、AS2を大きく越える試薬とはならなかった。2)AS2の安定性を高めるためにN-末のLeucineをD-Leucineに置き換えたDLAS2を作った。この試薬は予想通り安定性が増し、細胞内での残存率が飛躍的に高まった。しかし、リン酸化反応がAS2に比べて遅くなっていた。従って、リン酸化の測度を正確に測定することは難しいものと思われるが、長時間の計測には有効と思われる。3)AS2にはCa活性化カルモデュリンとの結合による470nmの蛍光上昇が見られ、これがリン酸化測定の精度をやや鈍らせていた。そこで、Caおよびカルモデュリン存在下でAS2の470nmの蛍光が少ない試薬として、Syntide2の基礎となった基質、グリコーゲンシンターゼのCaMKIIによるリン酸化部位の部分ペプチドを参考として、C-末をLE(Leucine-glutamic acid)に置き換えた試薬にAcrylo daneを結合した試薬、LEAS2を創製したこの試薬についてはCa/カルモデュリンとの反応の際に470nmの蛍光はほとんど生じなかった。この試薬のリン酸化はAS2より遅く、また、リン酸化によって蛍光強度が減少した。4)さらに本年度はCaMKIIの自己リン酸化部位の部分ペプチドを参考として新しい試薬の作製に着手した。

我们已经成功地创建了荧光CAMKI可视化试剂（AS2），并且我们计划了这项研究，目的是进一步提高其稳定性，灵敏度和选择性。今年，在以下几点上取得了研究进度：1）提高AS2的荧光强度（DS2），其中daCM（N-（7-二甲基Lamino-4-甲基-4-甲基 - 丙酰胺基） - 甲酰亚胺）与丙烯烷相连。该试剂肯定会发出比AS2更强的荧光光，但剧毒略有毒性，并且没有显着超过AS2。 2）为了提高AS2的稳定性，我们创建了DLAS2，该DLAS2用D-亮氨酸取代N末端亮氨酸。如预期的那样，该试剂的稳定性提高，并大大提高了细胞内的残留率。但是，磷酸化反应比AS2慢。因此，准确的磷酸化测量可能很困难，但它们可能对长期测量有效。 3）由于与CA激活的钙调蛋白结合，在470 nm处观察到AS2的荧光升高，这略微抑制了磷酸化测量的准确性。因此，作为一种在Ca和Calodulin存在下几乎没有荧光在470 nm处AS2的试剂，构成syntide2的底物（由糖原合酶的Camkii在磷酸化位点的部分肽）的底物用作LETER（c-terminus inter inter and），用作lelirtiCine and interaminus and interaminus and interaminus and interaminus andiminus interiminus andiminus。与CA/CALIDULIN反应时，荧光为470 nm。该试剂的磷酸化比AS2慢，磷酸化降低了荧光强度。 4）此外，今年，我们开始在CAMKII的自磷酸化位点使用部分肽制备新试剂作为参考。

项目成果

Tanaka,E., Yamamoto,S., Kudo,Y., Mihara,S.and Higashi,H.: "Mechanisms underlying the rapid depolarization produced by deprivation of oxygen and glucose in rat hippocampal CA1 neurons in vitro" J.Neurophysiol.78. 891-902 (1997)

Tanaka,E.、Yamamoto,S.、Kudo,Y.、Mihara,S. 和 Higashi,H.：“体外大鼠海马 CA1 神经元缺氧和葡萄糖产生快速去极化的机制”J.Neurophysiol。

Uchino,S., Kudo,Y., Watanabe,W., Nakajima-Iijima,S and Mishina,M.: "Inducible expression of N-methyl-D-aspartate(NMDA)receptyor channels from cloned cDNA in CHO cells" Mol.Brain Res. 44. 1-11 (1997)

Uchino,S.、Kudo,Y.、Watanabe,W.、Nakajima-Iijima,S 和 Mishina,M.：“CHO 细胞中克隆 cDNA 的 N-甲基-D-天冬氨酸 (NMDA) 受体通道的诱导表达”Mol

工藤 佳久、東 秀好: "生細胞におけるCa2+/CaMIIキナーゼの可視化解析" 細胞工学. 16. 64-69 (1997)

Yoshihisa Kudo、Hideyoshi Higashi：“活细胞中 Ca2+/CaMII 激酶的可视化分析”《细胞工程》16. 64-69 (1997)。

工藤佳久(共著): "バイオイメージング" 曽我部正博、臼倉治郎編集 共立出版, 266 (1998)

Yoshihisa Kudo（合著者）：“Bioimaging”Masahiro Sogabe、Jiro Usukura（编辑）Kyoritsu Shuppan，266（1998）

Higashi,H., Sato,K., Ohtake,A., Omori,A., Yoshisa,S.and Kudo,Y.: "Imaging of cAMP-dependent protein kinase activity in living neural cells using a novel fluorescent substrate" FEBS Letters. 414. 50-60 (1997)

Higashi,H.、Sato,K.、Ohtake,A.、Omori,A.、Yoshisa,S. 和 Kudo,Y.：“使用新型荧光底物对活神经细胞中 cAMP 依赖性蛋白激酶活性进行成像” FEBS