細胞の複製:分裂シグナル伝達機構の研究

细胞复制：分裂信号转导机制研究

基本信息

批准号：
05249205
负责人：
馬渕一誠
金额：
$ 1.28万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

私達はこれまで、「分裂シグナル伝達」にタンパク質リン酸化が関わっていることを強く示唆する結果を得ている。タンパク質リン酸化の重要な候補としてミオシン軽鎖のリン酸化が考えられた。そこで、分裂に伴い、卵ミオシンのリン酸化状態が変動するかどうかを調べた。次いで、低分子量Gタンパク質の一つrhoが収縮環の形成に関与するかどうかを検討した。1.ウニ卵ミオシンをミオシン軽鎖キナーゼ(MLCK)でリン酸化すると、アクチンによってATPaseが活性化されるようになることを示した。また、in vitroでは卵ミオシン調節軽鎖はMLCKとCキナーゼ又は、MPF(中期促進因子)によってそれぞれの特定部位がリン酸化された。次に卵を〔^<32>P〕正リン酸でラベルし、受精後一定時間ごとに卵抽出液を調製し、そこから卵ミオシン抗体を用いてミオシンを免疫沈降して調節軽鎖のリン酸化状態をリン酸化部位とリン酸化量の両面から検討した。その結果、分裂時期にかかわらず常に20%程度の軽鎖がリン酸化されており、リン酸化部位はMLCKによる部位のみが検出された。2.細胞分裂におけるrhoの役割を研究する手段として、ボツリヌス菌の産生するC3酵素が、rhoをADP-リボシル化してこれを不活性化するという性質を利用した。分裂前のウニ卵にC3酵素を注入したところ細胞質分裂は全くおこらず、核分裂のみ正常に進行して多核の胚に発生した。また、分裂中の卵にC3酵素を注入すると分裂溝は元に戻ってしまった。これら注入卵では収縮環アクチン繊維が欠失していた。更にin vitro実験で、単離分裂溝中のC3酵素の標的はrhoAであることが確認された。これらのことからrhoが分裂シグナル伝達ならびに収縮環の構造維持に働いている可能性が強く示唆された。

到目前为止，我们获得的结果强烈表明蛋白质磷酸化参与“有丝分裂信号转导”。肌球蛋白轻链的磷酸化被认为是蛋白质磷酸化的重要候选者。因此，我们研究了卵肌球蛋白的磷酸化状态在细胞分裂过程中是否发生变化。接下来，我们研究了 rho（一种低分子量 G 蛋白）是否参与收缩环的形成。 1. 我们发现，当海胆卵肌球蛋白被肌球蛋白轻链激酶（MLCK）磷酸化时，ATPase 被肌动蛋白激活。此外，在体外，卵肌球蛋白调节轻链在特定位点被 MLCK、C 激酶或 MPF（中期促进因子）磷酸化。接下来，用[^ 32 P]正磷酸标记卵，并在受精后定期制备卵提取物，并使用卵肌球蛋白抗体从其中免疫沉淀肌球蛋白，以磷酸化调节轻链并检查其氧化状态。磷酸化位点和磷酸化量。结果，无论分裂阶段如何，大约 20% 的轻链总是被磷酸化，并且仅检测到 MLCK 磷酸化位点。 2. 作为研究rho在细胞分裂中的作用的一种手段，我们利用肉毒杆菌产生的C3酶的特性，通过ADP核糖基化来灭活rho。当海胆卵在分裂前注射C3酶时，根本不发生胞质分裂，只有核分裂正常进行，产生多核胚胎。此外，当C3酶被注入分裂卵时，分裂沟恢复到原来的状态。这些注射的卵缺乏收缩环肌动蛋白纤维。此外，体外实验证实 rhoA 是分离的有丝分裂沟中 C3 酶的靶标。这些发现强烈表明 rho 可能在有丝分裂信号转导和收缩环结构的维持中发挥作用。