細胞の複製:分裂シグナル伝達機構の研究

细胞复制：分裂信号转导机制研究

基本信息

批准号：
05249205
负责人：
馬渕一誠
金额：
$ 1.28万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

私達はこれまで、「分裂シグナル伝達」にタンパク質リン酸化が関わっていることを強く示唆する結果を得ている。タンパク質リン酸化の重要な候補としてミオシン軽鎖のリン酸化が考えられた。そこで、分裂に伴い、卵ミオシンのリン酸化状態が変動するかどうかを調べた。次いで、低分子量Gタンパク質の一つrhoが収縮環の形成に関与するかどうかを検討した。1.ウニ卵ミオシンをミオシン軽鎖キナーゼ(MLCK)でリン酸化すると、アクチンによってATPaseが活性化されるようになることを示した。また、in vitroでは卵ミオシン調節軽鎖はMLCKとCキナーゼ又は、MPF(中期促進因子)によってそれぞれの特定部位がリン酸化された。次に卵を〔^<32>P〕正リン酸でラベルし、受精後一定時間ごとに卵抽出液を調製し、そこから卵ミオシン抗体を用いてミオシンを免疫沈降して調節軽鎖のリン酸化状態をリン酸化部位とリン酸化量の両面から検討した。その結果、分裂時期にかかわらず常に20%程度の軽鎖がリン酸化されており、リン酸化部位はMLCKによる部位のみが検出された。2.細胞分裂におけるrhoの役割を研究する手段として、ボツリヌス菌の産生するC3酵素が、rhoをADP-リボシル化してこれを不活性化するという性質を利用した。分裂前のウニ卵にC3酵素を注入したところ細胞質分裂は全くおこらず、核分裂のみ正常に進行して多核の胚に発生した。また、分裂中の卵にC3酵素を注入すると分裂溝は元に戻ってしまった。これら注入卵では収縮環アクチン繊維が欠失していた。更にin vitro実験で、単離分裂溝中のC3酵素の標的はrhoAであることが確認された。これらのことからrhoが分裂シグナル伝達ならびに収縮環の構造維持に働いている可能性が強く示唆された。

到目前为止，我们已经获得了结果，强烈表明蛋白质磷酸化参与了“分裂信号”。肌球蛋白光链的磷酸化被认为是蛋白质磷酸化的重要候选者。因此，我们研究了卵肌球蛋白的磷酸化状态是否随着分裂而变化。接下来，研究了低分子量G蛋白之一Rho是否参与了收缩环的形成。 1。我们表明，用肌球蛋白轻链激酶（MLCK）磷酸化导致肌动蛋白激活ATPase。此外，在体外，MLCK，C激酶或MPF（中期启动子）在特定部位磷酸化卵肌球蛋白调节轻链。接下来，用[^<32> p]正磷酸盐标记卵，并在受精后的一定时间段内制备卵提取物，并使用卵肌球蛋白抗体对磷酸化链的磷酸化状态进行免疫沉淀，以检查磷酸化位点的磷酸化状态和磷酸化的量。结果，无论划分时间如何，大约20％的轻链始终被磷酸化，并且仅检测到MLCK位置为磷酸化位点。 2。作为研究Rho在细胞分裂中的作用的一种手段，我们利用了肉毒杆菌ADP-核糖基化Rho的C3酶产生的特性并灭活了。当分裂前将C3酶注入海胆卵中时，没有发生细胞因子，并且只有核裂变正常进展，从而导致多核胚胎。此外，当将C3酶注入分隔卵中时，有丝分裂恢复。这些注入的卵有收缩环肌动蛋白纤维的缺失。此外，体外实验证实了分离的裂变凹槽中C3酶的靶标是RhoA。这些结果强烈表明RHO可能在有丝分裂信号传导和保持收缩环的结构中起作用。