Roles of liquid-liquid phase separation in DNA double-strand break repair

液-液相分离在DNA双链断裂修复中的作用

• 批准号: 22H03743
• 负责人: 香川 亘
• 金额: $ 11.15万
• 依托单位: Meisei University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22H03743/
• 关键词: 液-液相分離; DNA二重鎖切断; DNA修復; RAD52; RNA

Rad52は，酵母からヒトまで真核生物において広く保存されており，DNA二重鎖切断（DSB）損傷を修復する機構ではたらくと考えられている。酵母では，Rad52は修復の初期過程でDSBに集積し，Rad51タンパク質を損傷部位に呼び込んで修復反応を促進する。ヒト培養細胞においてもRAD52はDSB依存的に集積することが示されており，損傷部位へのRAD52の集積はDNA修復機構における重要なステップであることが考えられる。しかし，RAD52が損傷部位に集積する分子機構は不明な点が多い。そこで本研究では，ヒトRAD52がDNA損傷部位に集積する分子メカニズムとして液-液相分離が関与する可能性を検討した。ヒトRAD52の液滴形成をin vitroで検証するために，RAD52-GFPの大量調製系を確立した。それと並行してRAD52の天然変性領域内のlow complexity配列をアラニンに置換した変異体を複数種類作製し，野生型と同様の方法で液滴形成を検証した。RAD52-GFPを含む溶液はタンパク質凝集剤であるデキストランと混和することで透明な状態から濁った状態に変化した。この溶液にKClを加えると透明な状態に戻ることから，RAD52-GFPの凝集は可逆的であることがわかった。デキストランで凝集させたRAD52-GFPを蛍光顕微鏡で観察したところ，直径1~5 μmの球状の粒子が観察された。粒子を含む溶液に1,6-hexanediolを加えたところ，粒子が消失したことから，RAD52-GFPの液滴は液-液相分離によって形成されたことが強く示唆された。次に，low complexity配列に変異を導入したRAD52-GFPについても同様の解析を行った。その結果，RPA結合領域の近傍に変異を導入したRAD52-GFPにおいて，液滴形成能が野生型と比べ，顕著に低下していることがわかった。

Rad52 在从酵母到人类的真核生物中广泛保守，并且被认为在修复 DNA 双链断裂 (DSB) 损伤的机制中发挥作用。在酵母中，Rad52 在修复的早期过程中在 DSB 处积聚，将 Rad51 蛋白吸引到受损部位并促进修复反应。 RAD52也已被证明以DSB依赖性方式在培养的人类细胞中积累，并且RAD52在受损位点的积累被认为是DNA修复机制中的重要步骤。然而，RAD52 在受损位点积累的分子机制仍不清楚。因此，在本研究中，我们研究了液-液相分离作为人RAD52在DNA损伤位点积累的分子机制的可能性。为了验证人RAD52的体外液滴形成，我们建立了RAD52-GFP的大规模制备系统。与此同时，我们创建了多个突变体，其中 RAD52 自然简并区域中的低复杂性序列被丙氨酸取代，并使用与野生型相同的方法验证了液滴形成。当与蛋白质絮凝剂葡聚糖混合时，含有 RAD52-GFP 的溶液从透明状态变为混浊状态。当向该溶液中添加 KCl 时，它恢复到透明状态，表明 RAD52-GFP 聚集是可逆的。当使用荧光显微镜观察与葡聚糖聚集的RAD52-GFP时，观察到直径为1至5μm的球形颗粒。当将1,6-己二醇添加到含有颗粒的溶液中时，颗粒消失，强烈表明RAD52-GFP液滴是通过液-液相分离形成的。接下来，对 RAD52-GFP 进行了类似的分析，其中将突变引入到低复杂性序列中。结果表明，在 RPA 结合区域附近引入突变的 RAD52-GFP 与野生型相比，其液滴形成能力显着降低。

项目成果

ヒト RAD52 の液-液相分離における C 末端側領域の役割

C端区域在人RAD52液-液相分离中的作用

• 发表时间: 2022
• 作者: Igarashi T;Yasuhara T;Yano K;Zou L;and Shiotani;B;木下 千明，土屋 怜平，鴨井 一輝，滝沢 由政，胡桃坂 仁志，香川 亘
• 通讯作者: 木下 千明，土屋 怜平，鴨井 一輝，滝沢 由政，胡桃坂 仁志，香川 亘

生化学的解析から見えてきたRAD52のRNA依存的DNA修復における機能

生化分析揭示 RAD52 在 RNA 依赖性 DNA 修复中的功能

• 发表时间: 2022
• 作者: 土屋 怜平;五月女 美香;木下 千明，鴨井 一輝，荻野 駿，香川 亘
• 通讯作者: 木下 千明，鴨井 一輝，荻野 駿，香川 亘