Roles of liquid-liquid phase separation in DNA double-strand break repair

液-液相分离在DNA双链断裂修复中的作用

• 批准号: 22H03743
• 负责人: 香川 亘
• 金额: $ 11.15万
• 依托单位: Meisei University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22H03743/
• 关键词: 液-液相分離; DNA二重鎖切断; DNA修復; RAD52; RNA; 液-液相分離; DNA二重鎖切断; DNA修復; RAD52; RNA

Rad52は，酵母からヒトまで真核生物において広く保存されており，DNA二重鎖切断（DSB）損傷を修復する機構ではたらくと考えられている。酵母では，Rad52は修復の初期過程でDSBに集積し，Rad51タンパク質を損傷部位に呼び込んで修復反応を促進する。ヒト培養細胞においてもRAD52はDSB依存的に集積することが示されており，損傷部位へのRAD52の集積はDNA修復機構における重要なステップであることが考えられる。しかし，RAD52が損傷部位に集積する分子機構は不明な点が多い。そこで本研究では，ヒトRAD52がDNA損傷部位に集積する分子メカニズムとして液-液相分離が関与する可能性を検討した。ヒトRAD52の液滴形成をin vitroで検証するために，RAD52-GFPの大量調製系を確立した。それと並行してRAD52の天然変性領域内のlow complexity配列をアラニンに置換した変異体を複数種類作製し，野生型と同様の方法で液滴形成を検証した。RAD52-GFPを含む溶液はタンパク質凝集剤であるデキストランと混和することで透明な状態から濁った状態に変化した。この溶液にKClを加えると透明な状態に戻ることから，RAD52-GFPの凝集は可逆的であることがわかった。デキストランで凝集させたRAD52-GFPを蛍光顕微鏡で観察したところ，直径1~5 μmの球状の粒子が観察された。粒子を含む溶液に1,6-hexanediolを加えたところ，粒子が消失したことから，RAD52-GFPの液滴は液-液相分離によって形成されたことが強く示唆された。次に，low complexity配列に変異を導入したRAD52-GFPについても同様の解析を行った。その結果，RPA結合領域の近傍に変異を導入したRAD52-GFPにおいて，液滴形成能が野生型と比べ，顕著に低下していることがわかった。

从酵母到人类，Rad52在真核生物中广泛保守，被认为可以用一种修复DNA双链破裂（DSB）损害的机制起作用。在酵母中，RAD52在修复的早期阶段积聚在DSB中，将Rad51蛋白吸引到损伤部位以促进修复反应。已经表明，rad52以DSB依赖性方式积聚在人培养的细胞中，并且人们认为Rad52在损伤部位的积累是DNA修复机制中重要的一步。但是，关于RAD52在损伤部位积累的分子机制有许多未知数。因此，在这项研究中，我们研究了液态液相可能与人rad52在DNA损伤部位积聚的分子机制有关的可能性。为了验证体外人类Rad52液滴形成，建立了RAD52-GFP的大规模制备系统。同时，将自然变性区域内的低复杂性序列替换为丙氨酸的多种变体，并以与野生型相同的方式验证了液滴形成。与葡萄糖葡萄糖混合时，包含RAD52-GFP的溶液从透明状态变为多云。将KCL添加到该溶液中可以恢复其清晰的状态，发现Rad52-GFP的聚集是可逆的。当在荧光显微镜下观察到与葡聚糖聚集的RAD52-GFP时，观察到直径为1至5μM的球形颗粒。当将1,6-己二醇添加到包含颗粒的溶液中时，颗粒消失了，强烈表明Rad52-GFP的液滴是通过液 - 液相分离形成的。接下来，对RAD52-GFP进行了类似的分析，该分析在低复杂度序列中引入了突变。结果，发现与野生型相比，RAD52-GFP中的液滴形成能力显着降低，后者在RPA结合区域附近引入了突变。