糖鎖工学基盤に基づいたコンドロイチン硫酸による神経分化促進機構の解明

基于糖工程阐明硫酸软骨素促进神经元分化的机制

• 批准号: 22H03192
• 负责人: 柿崎 育子
• 金额: $ 10.48万
• 依托单位: Hirosaki University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22H03192/
• 关键词: コンドロイチン硫酸; 神経; 分化; 糖鎖工学

本研究では，コンドロイチン硫酸のE構造によって神経細胞への分化がなぜ促進されるか，コンドロイチン硫酸鎖中にE構造がどのように配置することが分化促進に重要であるかを明らかにすることを目的としている。そのために，今年度は，以下の計画を実施した。１）E構造による神経細胞への分化促進に関わる分子の探索：幹細胞の性質をもつマウス胚性腫瘍細胞株P19細胞に対し，all-trans-レチノイン酸で神経系細胞へと分化誘導した。この分化のモデル培養系にコンドロイチン硫酸Eを添加して，各タイムポイントで回収した細胞からRNAとタンパク質を抽出した。神経細胞のマーカーの発現変動をリアルタイムPCRで調べることにより，分化に及ぼすE構造の促進効果を確認したのち，同じRNA試料を用いてDNAマイクロアレイを実施した。分化の過程で変動する遺伝子をピックアップし，その発現量の経時的変化をプロットすることにより，コンドロイチン硫酸E添加の有無での変動のパターンを比較した。分化の過程で変動する遺伝子について膨大な情報が得られるとともに，コンドロイチン硫酸Eで発現変動パターンに影響を受ける遺伝子も多数見出された。２）コンドロイチン硫酸のE構造をもつ解析ツールの作製：分化促進に必要なE構造のコンドロイチン硫酸鎖中での配置を調べるために，糖鎖長や立体構造が異なる解析ツールとしてのコンドロイチン硫酸誘導体を作製した。これまでの実験結果から，受容体との結合にはある程度の糖鎖長かプロテオグリカン様の構造が必要な可能性が推定された。今年度は，E構造を長い糖鎖の末端に導入する糖鎖工学的基盤技術の確立を目指す第一歩として，計画している反応の原材料としてのオリゴ糖を調製し，それに対する有機化学的な反応および酵素を用いた反応の条件検討を行った。一方で，反応生成物の分離法，構造の評価法を検討した。

在本研究中，我们旨在阐明为什么硫酸软骨素的E结构促进分化为神经细胞，以及E结构在硫酸软骨素链中的排列方式对于促进分化具有重要的目的。为此，今年我们实施了以下计划。 1）通过E结构寻找参与促进分化为神经细胞的分子：P19细胞是具有干细胞特性的小鼠胚胎肿瘤细胞系，用全反式视黄酸诱导分化为神经系统细胞。在该分化模型培养体系中添加硫酸软骨素E，从各时间点收集的细胞中提取RNA和蛋白质。通过实时PCR检查神经元标记物表达的变化，确认E结构对分化的促进作用后，使用相同的RNA样品进行DNA微阵列分析。通过选取在分化过程中波动的基因并绘制其表达水平随时间的变化，我们比较了添加和不添加硫酸软骨素 E 的波动模式。获得了大量关于分化过程中发生变化的基因的信息，并且还发现了许多表达模式受硫酸软骨素E影响的基因。 2) 硫酸软骨素E结构分析工具的制作：为了研究促进硫酸软骨素链分化所需的E结构的排列，我们制作了不同糖链长度的硫酸软骨素衍生物作为分析工具，创建了三维结构。从迄今为止的实验结果来看，估计与受体结合可能需要一定量的糖链长度或蛋白聚糖样结构。今年，作为建立在长糖链末端引入E结构的基础糖工程技术的第一步，我们将准备寡糖作为计划反应的原料，并对其进行有机化学反应，我们研究了其条件。各种反应和使用酶的反应。另一方面，我们研究了分离反应产物并评估其结构的方法。