フラビウイルス蛋白質量恒常性維持の分子機構解明

阐明黄病毒蛋白稳态维持的分子机制

基本信息

批准号：
22H02873
负责人：
森田英嗣
金额：
$ 10.98万
依托单位：
Hirosaki University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2026-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

研究項目1. 一部のウイルス非構造蛋白質のみが選択的にERADで分解される分子機構の解明：日本脳炎ウイルスのEタンパク質、prMタンパク質とNS1タンパク質の糖鎖修飾を欠損させた変異体の安定性が著しく減弱することを見出した。また、これらの変異体ではウイルス増殖が著しく抑制されていた。これらの結果は、糖鎖修飾にウイルスタンパク質のフォールディングを助ける作用があることを示しており、糖鎖修飾はERADによる認識に利用されていることを示している。研究項目2. ウイルス感染細胞内でERAD因子が集積するコンボリューティッド膜(CM)の解析：日本脳炎ウイルスNS4AのC末端領域がCM膜形成に必要な宿主因子LNPとの相互作用に必要であることを明らかにした。また、タイムラプスイメージング解析によりLNPがウイルス複製オルガネラに集積する動態を捉えることに成功した。研究項目3. ２種類の異なるCM構造の役割と形成・維持機構の解明：電子線トモグラフィーによるCM膜構造データのさらなる取得を進めた。さらに、凍結細胞活断によるオスミウム浸軟法によるCM膜構造の3D走査型電子顕微鏡（SEM）イメージの取得も進めてきた。複製オルガネラ解析のためのオスミウム浸軟法SEM解析の固定方法を確立した。研究項目4.他のストレス誘導時に見られるCM様構造との比較解析(ウイルス因子のViroporinとしての役割) ：タプシガルギン処理によって出現するCM様構造の電子顕微鏡解析を行い、CM様構造データを取得した。また、Fura 2-AM を用いたカルシウムイオン濃度変化測定の条件検討を進め、各ウイルスタンパク質発現によるカルシウムチャネル活性を同定することに成功した。

研究项目1。经典分子机制，其中仅某些病毒非结构蛋白在ERAD中有选择地分解：日本脑炎病毒的E-蛋白质，这是缺乏PRM蛋白质糖链修饰和NS1的突变体的稳定性蛋白质。在这些变体中，病毒增殖得到了极大的抑制。这些结果表明，糖链修饰具有帮助病毒邮票折叠的作用，表明糖链修饰用于ERAD识别。研究项目2。在病毒感染细胞中积累的comboutid膜（CM）：NS4A NS4A C末端对于与CM膜形成所需的Lord因子LNP相互作用是必要的。此外，时间失去成像分析成功地捕获了在病毒重复的有机埃拉（Organella）中积累的LNP的动力学。研究项目3。两种不同CM结构的作用以及形成和维护机制的分类：通过电子线层析成像进一步获取CM膜结构数据。此外，由于冻结的细胞，通过男性浸入法获得了CM膜结构的3D扫描电子显微镜（SEM）图像。已经建立了一种修复Miumure软化方法SEM分析进行重复的有机分析的方法。研究项目4。在其他应力诱导期间发现的类似CM的结构（作为病毒因子的Viroporin的作用）：对CM结构的电子显微镜分析已经进行了tapsigalgin处理，并且已经获得了CM结构数据。此外，促进了使用Fura 2-AM钙离子浓度变化测量的状况，并成功地通过每种病毒邮票的表达表达钙通道活性。