Time-resolved measurements of allocrite transport in ABC transporters

ABC 转运蛋白中 allocrite 转运的时间分辨测量

基本信息

批准号：
22H02198
负责人：
木村哲就
金额：
$ 11.48万
依托单位：
Kobe University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

2021年度までに界面活性剤を用いて可溶化したヘムABCトランスポーターBhuUVを用いて計測を行い、時間分解紫外/可視吸収分光、赤外吸収分光に成功していた。しかし、輸送基質であるヘムと界面活性剤であるDDMが非特異的に相互作用し、紫外/可視吸収スペクトルに特徴的なピークを示すため、バックグラウンドとしてスペクトルを歪ませてしまうことから、2022年度においては BhuUVをナノディスク化あるいは amphipol (PMAL-C8)によって可溶化することによって溶媒から界面活性剤を除去することを試みた。その結果、バックグラウンドの大幅な低減および、nd-BhuUV あるいは amphipol 再構成BhuUVとヘムとの相互作用をより特異的に観察できることが確認された。しかし、nd-BhuUV の収率は10%と低く、BhuUVの収量が低いことと合わせて、分光測定を行うためには現実的でないことも留意しなければならない。本研究は ATPの結合・加水分解反応、ペリプラズムタンパク質(BhuT) とBhuUV の膜貫通ドメインの離合・集散、輸送基質であるヘムの受け渡し・輸送、核酸結合ドメインおよび膜貫通ドメインのコンフォメーション変化、という4つのダイナミクスの相関を明らかにすることを目的としたものである。2022年度は上記のDDM再構成あるいは amphipol 再構成BhuUVを用いて、ヘム輸送ダイナミクスを、研究代表者が平成25年度に構築したマイクロ秒の時間分解能をもつ自作の時間分解可視吸収スペクトル測定装置を用いて精密計測を行った。また、2価および3価の鉄イオンを含有するヘムによって輸送に違いが起こるかどうかを確認するために、特に還元型での計測を安定に行う事のできる嫌気チャンバーを導入し、時間分解測定を行えるように設定した。

通过FY2021，使用HEM ABC转运蛋白Bhuuv进行了测量，该测量使用表面活性剂溶液，并在时间化的紫外线/视觉吸收和红外吸收中成功。然而，下摆，传输系统和表面活性剂DDM，DDM充当扭曲频谱作为背景的背景，以显示超/可见的吸收频谱中的特征峰。通过通过纳米虫或amphipol（PMAL-C8）求解Bhuuv，从溶剂中清除表面活性剂。结果，已经证实，背景可以显着降低，并且Nd-Bhuuv或Amphipol重建的Bhuuv和Hem之间的相互作用可以更具体。但是，必须注意的是，ND-Bhuuv的产量低至10％，而Bhuuv的低收率对于进行光谱测量不现实。这项研究是ATP的组合 /水解反应，腹膜蛋白（BHUT）和Bhuuv的分离 /分散体，HEM的交易和转运，即传输系统，以及核酸键构象的变化域和薄膜穿透域是阐明四个动态相关性。在2022年，使用上述DDM重建或Amphipol重建的Bhuuv，研究代表使用了Hem Transper Dynamics，该动力学的时间分辨率是2013年建造的微秒的时间分辨率。我们进行了精确测量。此外，为了确认由于下摆是否含有翻倍和三个金属铁离子而导致的运输差异，可以在赎回类型中特别稳定进行厌氧室，并设置时间分解这样你就可以做到。

项目成果

期刊论文数量（20）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

鉄還元膜タンパク質101F6-ナノディスクにおける電子移動反応の分光分析

铁还原膜蛋白 101F6-Nanodiscs 中电子转移反应的光谱分析

DOI：
发表时间：
2022
期刊：
影响因子：
0
作者：
山口葵;鍔木基成;木村哲就
通讯作者：
木村哲就

101F6ナノディスクによる電子移動反応の実験的解析

101F6纳米盘电子转移反应的实验分析

DOI：
发表时间：
2022
期刊：
影响因子：
0
作者：
山口葵;鍔木基成;木村哲就
通讯作者：
木村哲就

ナノディスクに再構成した鉄還元膜タンパク質CYB561D2 によって誘起される脂質過酸化の解析

铁还原膜蛋白 CYB561D2 重构纳米盘诱导的脂质过氧化分析

DOI：
发表时间：
2022
期刊：
影响因子：
0
作者：
山口葵;鍔木基成;木村哲就
通讯作者：
木村哲就

Microspectroscopic systemsfor time-resolved measurementsof protein microcrystals

用于蛋白质微晶时间分辨测量的显微光谱系统

DOI：
发表时间：
2022
期刊：
影响因子：
0
作者：
笹江優作;阿部純平;梶原康宏;伊藤幸成;Tetsunari KIMURA
通讯作者：
Tetsunari KIMURA

イクオリン -Ca2+ 間相互作用の熱力学的解析

水母发光蛋白-Ca2+相互作用的热力学分析

DOI：
发表时间：
2022
期刊：
影响因子：
0
作者：
Nakamatsu Seita;Kikuma Takashi;Hashiguchi Yuji;Tada Sato;Sano;Kanae;Ito Yukishige;Takeda Yoichi;黒木麗,船橋俊也,大西裕介,中津亨,木村哲就
通讯作者：
黒木麗,船橋俊也,大西裕介,中津亨,木村哲就