E3ユビキチンリガーゼCUL3による血管新生制御機構の解析

E3泛素连接酶CUL3调控血管生成机制分析

• 批准号: 25893160
• 负责人: 坂上 倫久
• 金额: $ 2.16万
• 依托单位: Ehime University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
• 财政年份: 2013
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2013-08-30 至 2015-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-25893160/
• 关键词: CUL3; VEGFR2; BTB; angiogenesis

最近我々は、E3ユビキチンリガーゼの一つであるCUL3が血管新生に極めて重要であることを発見した。その中でCUL3は、VEGFR2 mRNAの安定制御を通じて血管内皮細胞機能に関与することを新たに見出した。本研究は、CUL3によるVEGFR2 mRNA制御機構に焦点を当て、血管内皮細胞においてCUL3が標的とする基質およびそのアダプタータンパク質を同定し、血管新生におけるCUL3複合体の果たす生理的役割を明らかにすることを目指すものである。はじめに、VEGFR2-3' untranslated region（UTR）をベイトとしたプルダウン法によって、VEGFR2 mRNA安定性を制御する因子の同定を行う計画を進めたが、ベイト調整が非常に困難で時間を要したため、アダプタータンパク質を同定する実験を優先的に進めるここととした。CUL3のアダプタータンパク質はBTBドメイン（BTBD）を持つことが知られ、ヒトでは180種程度存在することが知られている。この中で血管内皮細胞特異的に高発現するいくつかのBTBDタンパク質に対するsiRNAを合成し、VEGFR2 mRNAを制御するBTBDタンパク質のスクリーニングを行った。その結果、二つの因子（VEGFR2 regulating protein1 and 2）を同定することに成功した。これらのタンパク質を血管内皮細胞においてノックダウンすると、VEGFR2の発現が著しく低下することが分かった。これはCUL3ノックダウン時と同程度であった。一方で、本タンパク質を血管内皮細胞に過剰発現させると、VEGFR2の発現量が大幅に増強されることも分かった。また、293T細胞を用いたプルダウン実験より、同定した二つのBTBDタンパク質はCUL3と結合することを確認した。

我们最近发现 CUL3（一种 E3 泛素连接酶）对于血管生成至关重要。其中，我们新发现CUL3通过稳定调节VEGFR2 mRNA参与血管内皮细胞功能。本研究重点研究CUL3调控VEGFR2 mRNA的机制，鉴定血管内皮细胞中CUL3及其衔接蛋白的靶向底物，旨在阐明CUL3复合物在血管生成中的生理作用。首先，我们计划以VEGFR2-3'非翻译区（UTR）为诱饵，通过pull-down方法来识别控制VEGFR2 mRNA稳定性的因素，但调整诱饵极其困难且耗时，因此我们决定优先考虑进行实验来鉴定蛋白质。已知 CUL3 接头蛋白具有 BTB 结构域 (BTBD)，并且已知人类中存在大约 180 种类型。其中，我们合成了针对血管内皮细胞中特异性高表达的几种BTBD蛋白的siRNA，并筛选了调节VEGFR2 mRNA的BTBD蛋白。结果，他们成功鉴定了两个因子（VEGFR2 调节蛋白 1 和 2）。我们发现敲除血管内皮细胞中的这些蛋白可显着降低 VEGFR2 的表达。这与 CUL3 被击倒时的水平相同。另一方面，还发现当该蛋白在血管内皮细胞中过表达时，VEGFR2的表达水平显着增强。此外，使用 293T 细胞的 Pull-down 实验证实，两种已鉴定的 BTBD 蛋白与 CUL3 结合。

项目成果

生化学・分子遺伝学

生物化学/分子遗传学

Versatility of E3 ubiquitin ligase Cullin3 as an angiogenic balance regulator

E3 泛素连接酶 Cullin3 作为血管生成平衡调节剂的多功能性

• 发表时间: 2014
• 作者: Kenichiro Harada;Koji Matsuo;Hirotaka Yamagata;Mami Nakashima;Masayuki Nakano;Naoko Higuchi;Fumihiro Higuchi;Teruyuki Hobara;Koji Otsuki;Tomohiko Shibata;Toshio Watanuki;Katsuhiko Ueda;Matakazu Furukawa;Masaki Fukunaga;Yusuke Fujita;Keigo S;Tomohisa Sakaue
• 通讯作者: Tomohisa Sakaue