ラマン分光法によるハンチントン病凝集タンパク質の定量的モニタリングシステムの開発

使用拉曼光谱法开发亨廷顿病聚集蛋白定量监测系统

基本信息

批准号：
24890043
负责人：
長島優
金额：
$ 1.91万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
财政年份：
2012
资助国家：
日本
起止时间：
2012-08-31 至 2014-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-24890043/
关键词：
ハンチントン舞踏病ラマン分光法

项目摘要

①培養細胞内の凝集タンパク質の測定：GFPまたはmNeptune標識した変異Huntingtin exon-1タンパク質(98残基ポリグルタミン鎖を含む)をHela細胞・HEK293T細胞に強制発現させ，細胞内に封入体を形成させた．レーザーラマン顕微分光装置を用いて蛍光標識と共局在する封入体に特徴的なラマンスペクトル波形を検索した．封入体内部で観測されたラマンシフトうち，1012cm-1, 1559cm-1, 1617cm-1の3つのラマンシフトの組み合わせは観測視野内で封入体に特異的であった．伸長ポリグルタミン鎖はβ-sheet構造をとることが知られており，それが不溶性の理由とされる．封入体特異的なラマンシフトの一つ1617cm-1は，β-sheet構造に相当するアミドI結合の分子振動を見ている可能性がある．今回発見したラマンシフトは，生理的な封入体形成過程でのポリグルタミン分子の挙動を解明する上で重要なツールとなりうる．②ラマンスペクトルに出現する分子振動の推定システムの構築：構造式の定まった任意の分子についてその立体構造予測と分子振動解析を行い，ラマンスペクトルを理論的に予測する計算機システムを構築した．現在200～300原子以下の分子の計算が可能である．これを用いてグルタミンオリゴマーのラマンスペクトル予測を行い，実測結果と比較を行った．グルタミンオリゴマーの理論計算ラマンスペクトルには1617cm-1の振動モードは存在しなかった．この振動モードがグルタミン残基自体でなく，それ以外の分子振動(分子間の水素結合など)に由来する可能性を間接的にサポートする結果である．このような実測結果と計算結果との比較は，分子特異的マーカーとして機能する特徴的なスペクトルが確実に凝集タンパク質に由来することを，物理化学の理論面から保証するための必要不可欠な過程である．

1）测量培养细胞中聚集的蛋白质：GFP或Mneptune标记的突变突变体亨廷顿外显蛋白外显子-1蛋白（含有98个残留的聚谷氨酰胺链）被迫在HELA细胞和HEK293T细胞中表达，从而在细胞内形成包含物体。使用激光拉曼微光谱计，我们搜索了与荧光标签共定位的包含物体的拉曼光谱波形。在包含体内观察到的拉曼移位中，三个拉曼移位的组合是1012cm-1、1559cm-1和1617cm-1，是观测场中包含体的特定的。众所周知，扩展的聚谷氨酰胺链具有β-折叠结构，这是其不溶性性质的原因。包容性特定的拉曼偏移之一1617cm-1可能是看到酰胺I键的分子振动，这与β-折叠结构相对应。我们在这里发现的拉曼转移可能是阐明在生理包容形成过程中多谷氨酰胺分子行为的重要工具。 2。构建用于估计拉曼光谱中出现的分子振动的系统：我们已经构建了一个计算机系统，该系统通过预测三维结构并分析任何分子的分子的分子振动来预测理论上可以预测拉曼光谱。目前，可以计算厚度为200至300个原子的分子。这用于预测谷氨酰胺低聚物的拉曼光谱，并将其与实际测量结果进行了比较。在谷氨酰胺低聚物的理论拉曼谱中，没有1617cm-1的振动模式。这导致间接支持这种振动模式不是源自谷氨酰胺残基本身，而是来自其他分子振动（例如分子之间的氢键）的可能性。比较实际测量和计算结果是从物理化学的理论方面确保作为分子特异性标记的特征光谱可靠地从聚合蛋白中可靠得出的，这是一个必不可少的过程。