ラマン分光法によるハンチントン病凝集タンパク質の定量的モニタリングシステムの開発

使用拉曼光谱法开发亨廷顿病聚集蛋白定量监测系统

基本信息

批准号：
24890043
负责人：
長島優
金额：
$ 1.91万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
财政年份：
2012
资助国家：
日本
起止时间：
2012-08-31 至 2014-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-24890043/
关键词：
ハンチントン舞踏病ラマン分光法

项目摘要

①培養細胞内の凝集タンパク質の測定：GFPまたはmNeptune標識した変異Huntingtin exon-1タンパク質(98残基ポリグルタミン鎖を含む)をHela細胞・HEK293T細胞に強制発現させ，細胞内に封入体を形成させた．レーザーラマン顕微分光装置を用いて蛍光標識と共局在する封入体に特徴的なラマンスペクトル波形を検索した．封入体内部で観測されたラマンシフトうち，1012cm-1, 1559cm-1, 1617cm-1の3つのラマンシフトの組み合わせは観測視野内で封入体に特異的であった．伸長ポリグルタミン鎖はβ-sheet構造をとることが知られており，それが不溶性の理由とされる．封入体特異的なラマンシフトの一つ1617cm-1は，β-sheet構造に相当するアミドI結合の分子振動を見ている可能性がある．今回発見したラマンシフトは，生理的な封入体形成過程でのポリグルタミン分子の挙動を解明する上で重要なツールとなりうる．②ラマンスペクトルに出現する分子振動の推定システムの構築：構造式の定まった任意の分子についてその立体構造予測と分子振動解析を行い，ラマンスペクトルを理論的に予測する計算機システムを構築した．現在200～300原子以下の分子の計算が可能である．これを用いてグルタミンオリゴマーのラマンスペクトル予測を行い，実測結果と比較を行った．グルタミンオリゴマーの理論計算ラマンスペクトルには1617cm-1の振動モードは存在しなかった．この振動モードがグルタミン残基自体でなく，それ以外の分子振動(分子間の水素結合など)に由来する可能性を間接的にサポートする結果である．このような実測結果と計算結果との比較は，分子特異的マーカーとして機能する特徴的なスペクトルが確実に凝集タンパク質に由来することを，物理化学の理論面から保証するための必要不可欠な過程である．

①培养细胞中聚集蛋白的测量：GFP或mNeptune标记的突变亨廷顿外显子1蛋白（含有98个残基的多谷氨酰胺链）在Hela细胞/HEK293T细胞中强制表达，在细胞内形成包涵体。使用激光拉曼显微光谱装置，我们寻找与荧光标记共定位的包涵体的拉曼光谱波形特征。在包涵体内部观察到的拉曼位移中，1012 cm-1、1559 cm-1和1617 cm-1这三种拉曼位移组合是观察视野内包涵体所特有的。众所周知，延长的聚谷氨酰胺链具有β-折叠结构，这被认为是其不溶性的原因。包涵体特异性拉曼位移之一为 1617 cm-1，可能是由于酰胺 I 键的分子振动所致，该键对应于 β-折叠结构。新发现的拉曼位移可以成为阐明多聚谷氨酰胺分子在生理包涵体形成过程中行为的重要工具。 ②构建用于估计拉曼光谱中出现的分子振动的系统：我们对任何具有固定结构式的分子进行3D结构预测和分子振动分析，并构建了理论上预测拉曼光谱的计算机系统。目前，可以计算少于 200 至 300 个原子的分子。利用这一点，我们预测了谷氨酰胺低聚物的拉曼光谱，并将其与实际测量结果进行了比较。理论计算的谷氨酰胺低聚物拉曼光谱在1617cm-1处没有振动模式。这一结果间接支持了这种振动模式并非源自谷氨酰胺残基本身而是源自其他分子振动（例如分子间氢键）的可能性。这种测量结果和计算结果的比较是从物理化学理论角度确保作为分子特异性标记的特征光谱肯定来自聚集的蛋白质的必要过程。