大腸内視鏡の生検検体を用いたChIPSeq法の開発ーH3K27me3の網羅的解析

使用结肠镜活检标本开发 ChIPSeq 方法 - H3K27me3 的综合分析

基本信息

批准号：
23890168
负责人：
丸山玲緒
金额：
$ 2.08万
依托单位：
Sapporo Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
财政年份：
2011
资助国家：
日本
起止时间：
2011-08-24 至 2013-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-23890168/
关键词：
大腸癌ヒストン修飾 H3K27me3 次世代シークエンサー ChIPSeq 内視鏡視鏡検体

项目摘要

まず初めに、大腸内視鏡の生検検体を用いてChIPSeqを行うための標準プロトコールを確立するべく、検体からの細胞分離の方法並びに次世代シークエンサー(SOLiD4)を用いたChIPSeq法のプロトコールの各段階を詳細に検討し、最適化を行った。検体からの細胞分離の方法としては、腺管分離法により直接上皮細胞成分のみを分離する方法を採用した。この改良したプロトコールを用いることで、微量な内視鏡生検検体、1x10^5個の細胞、1ng程度のChIP-DNAのサンプルからでもChIPSeq法を施行することが可能となり、十分に質の高い再現性のあるデータを得ることができた。次に実際に複数の内視鏡検体を用いてヒストン修飾K27me3に対するChIPSe像実験を施行した。バーコード技術を用いて一度に複数のChIPSeqサンプルをシークエンスすることにより、コストと時間を大幅に削減することができた。ほとんどのサンプルで質の高いデータを得ることができた。現在これらのChIPSeqデータをより詳細に解析中であり、今後更に検体数を増やしてヒストンH3K27me3に対するChIPSeqを施行し、果たしてこれが臨床的に有用な分子マーカーとなりうるかどうかの検証を行う予定である。本年度は、大腸内視鏡の生検検体を用いてChIPSeqを行うための標準プロトコールを確立することができた。本研究で確立されたプロトコールは、H3K27me3以外にも様々なヒストン修飾並びに転写因子に関して広汎に応用可能であり、大腸癌の臨床検体を用いた研究に大変有用なツールとなることが期待される。

首先，为了建立使用结肠镜检查活检标本进行 ChIPSeq 的标准方案，我们将开发一种从标本中分离细胞的方法以及使用下一代测序仪 (SOLiD4) 的 ChIPSeq 方案，并对这些步骤进行详细检查和研究。优化。作为从标本中分离细胞的方法，我们采用了利用导管分离法直接仅分离上皮细胞成分的方法。通过使用这种改进的方案，现在甚至可以对少量内窥镜活检标本、1x10^5 细胞和大约 1 ng ChIP-DNA 样品执行 ChIPSeq 方法，从而获得足够高质量的样品。以获得可重复的数据。接下来，我们使用多个内窥镜标本对组蛋白修饰 K27me3 进行了 ChIPSe 成像实验。通过使用条形码技术同时对多个 ChIPSeq 样品进行测序，我们能够显着降低成本和时间。我们能够获得大多数样本的高质量数据。我们目前正在更详细地分析这些 ChIPSeq 数据，并计划进一步增加样本数量，对组蛋白 H3K27me3 进行 ChIPSeq，以验证这是否可以成为临床上有用的分子标记。今年，我们能够建立使用结肠镜检查活检标本执行 ChIPSeq 的标准方案。本研究建立的方案可广泛应用于除H3K27me3之外的各种组蛋白修饰和转录因子，并且有望成为使用结直肠癌临床标本进行研究的非常有用的工具。