大腸内視鏡の生検検体を用いたChIPSeq法の開発ーH3K27me3の網羅的解析

使用结肠镜活检标本开发 ChIPSeq 方法 - H3K27me3 的综合分析

基本信息

批准号：
23890168
负责人：
丸山玲緒
金额：
$ 2.08万
依托单位：
Sapporo Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
财政年份：
2011
资助国家：
日本
起止时间：
2011-08-24 至 2013-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

まず初めに、大腸内視鏡の生検検体を用いてChIPSeqを行うための標準プロトコールを確立するべく、検体からの細胞分離の方法並びに次世代シークエンサー(SOLiD4)を用いたChIPSeq法のプロトコールの各段階を詳細に検討し、最適化を行った。検体からの細胞分離の方法としては、腺管分離法により直接上皮細胞成分のみを分離する方法を採用した。この改良したプロトコールを用いることで、微量な内視鏡生検検体、1x10^5個の細胞、1ng程度のChIP-DNAのサンプルからでもChIPSeq法を施行することが可能となり、十分に質の高い再現性のあるデータを得ることができた。次に実際に複数の内視鏡検体を用いてヒストン修飾K27me3に対するChIPSe像実験を施行した。バーコード技術を用いて一度に複数のChIPSeqサンプルをシークエンスすることにより、コストと時間を大幅に削減することができた。ほとんどのサンプルで質の高いデータを得ることができた。現在これらのChIPSeqデータをより詳細に解析中であり、今後更に検体数を増やしてヒストンH3K27me3に対するChIPSeqを施行し、果たしてこれが臨床的に有用な分子マーカーとなりうるかどうかの検証を行う予定である。本年度は、大腸内視鏡の生検検体を用いてChIPSeqを行うための標準プロトコールを確立することができた。本研究で確立されたプロトコールは、H3K27me3以外にも様々なヒストン修飾並びに転写因子に関して広汎に応用可能であり、大腸癌の臨床検体を用いた研究に大変有用なツールとなることが期待される。

首先，为了建立使用结肠镜检查样品进行CHIPSEQ的标准协议，从样品中的每个阶段进行了细胞分离方法，并使用下一代Sequencer（Solid4）进行了细胞分离方法的每个阶段，并进行了优化。作为将细胞与试样分离的方法，一种仅通过导管分离直接分离上皮细胞成分的方法。使用此改进的方案，即使从少量的内窥镜活检标本，1x10^5细胞和1 ng的芯片-DNA样品中，也可以执行Chipseq方法，从而获得足够高质量的和可再现的数据。接下来，使用多个内窥镜标本对组蛋白改性的K27me3进行了芯片图像实验。通过使用条形码技术立即对多个Chipseq样品进行测序，可以大大降低成本和时间。对于大多数样品，获得了高质量的数据。我们目前正在更详细地分析这些CHIPSEQ数据，并计划增加用于组蛋白H3K27me3的CHIPSEQ的标本数量，并验证这是否实际上可以是临床上有用的分子标记。今年，我们能够建立使用结肠镜检查样品进行CHIPSEQ的标准方案。本研究中建立的方案广泛适用于H3K27ME3以外的各种组蛋白修饰和转录因子，预计将是使用结肠癌临床标本的研究非常有用的工具。