タンパク質のニトロシル化とパルミトイル化修飾の相互制御システムの解析

蛋白质亚硝基化与棕榈酰化修饰的相互调控系统分析

• 批准号: 23890113
• 负责人: 足立 直子
• 金额: $ 2.08万
• 依托单位: Kobe University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
• 财政年份: 2011
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2011-08-24 至 2013-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-23890113/
• 关键词: パルミトイル化; ニトロシル化; パルミトイル化; ニトロシル化

(目的)タンパク質のS-パルミトイル化とS-ニトロシル化が同一システイン残基を修飾する可能性に着目し、S-ニトロシル化修飾がS-パルミトイル化修飾を直接阻害することでタンパク質の機能を制御し、細胞内情報伝達を変化させることを仮定し検証する。(研究実績)細胞モデルとしてRAW264.7マクロファージ細胞を使用し、LPS/IFNγ刺激によりiNOSの発現を誘導させることで、継続的に大量のNOを産生させた。この時iNOS特異的阻害薬である1400wを使用し、NO産生の有無の条件を作り出した。NOの産生は細胞培養液をSaville assayに供することで確認し、目的とする条件を作り出していることを確認した。次にこれらの条件下で培養した細胞の全分画をAcyl-RAC(パルミトイル化タンパク質の検出法)によりNO産生条件下においてパルミトイル化タンパク質が低下するかを確認したところ、NO存在下において明らかな違いは検出できなかった。これは、NOの有無に関わらず、多量のパルミトイル化タンパク質が検出されるために、NOの効果がマスクされてしまっていると考えられた。一方で、SNO-RAC(ニトロシル化タンパク質の検出法)に供したサンプルでは、予想通りニトロシル化タンパク質が上昇していることを確認した。しかしながら、これらの条件検討を行っている過程で、各翻訳後修飾の同定法に大きな検出感度の違いがあることが判明した。Acyl-RAC法によるパルミトイル化タンパク質の検出過程において、パルミトイル化修飾自体が比較的安定的であり、また、中性ヒドロキシルアミンによるパルミトイル化修飾の還元効率が大変高いのに比較して、SNO-RAC法によるニトロシル化タンパク質の検出過程においては、ニトロシル化タンパク質自体の不安定性に加えて、アスコルビン酸によるニトロシル化修飾の還元効率の低さが判明した。そこで、アスコルビン酸の濃度と反応時間を最適化し、SNO-RAC法の検出感度を大幅に上昇させた。

（目的）我们关注的是蛋白质的S-顶酰化和S-亚硝基化修饰相同的半胱氨酸残基，并且我们将测试S-硝基糖基化修饰直接抑制S-甲米酰化修饰，控制蛋白质功能并改变细胞内信号传导。 （研究结果）我们将RAW264.7巨噬细胞用作细胞模型，并刺激LPS/IFNγ来诱导iNOS表达，从而导致不断产生大量NO。目前，使用了一种iNOS特异性抑制剂1400W，以创造出存在或不存在无生产的条件。没有通过将细胞培养基进行萨维尔测定法确认生产，并确认产生了所需的条件。接下来，当通过酰基-RAC（一种检测棕榈酰化蛋白的方法）确定在这些条件下培养的细胞的全部部分，以确定在没有生产条件下是否降低了棕榈酰化的蛋白质，则在NO存在的情况下无法检测到明显的差异。这被认为是因为检测到大量棕榈酰化蛋白，而不论存在或不存在NO，这掩盖了NO的效果。另一方面，已经证实，在经受SNO-RAC（一种检测硝基基化蛋白的方法）的样品中，亚硝基化蛋白被升高。但是，在检查这些条件的过程中，发现在识别每个翻译后修饰的方法中，检测灵敏度存在显着差异。在通过酰基-RAC方法检测棕榈酰化蛋白的过程中，棕榈酰化修饰本身是相对稳定的，并且与与中性羟胺的棕榈酰化修饰的高还原效率相比，在检测硝酸蛋白质的过程中，还可以通过SNO-RAC方法来实现NINITOROSILT，从而构成了NINITOROSILT的反应。用抗坏血酸修饰的亚硝基化修饰的效率较低。因此，优化了抗坏血酸浓度和反应时间，并显着增加了SNO-RAC方法的检测灵敏度。