磁気ピンセットによるマウス胚左右軸決定におけるノード流の作用機構の解明

阐明节点流在磁力镊测定小鼠胚胎左右轴中的作用机制

基本信息

批准号：
23870018
负责人：
篠原恭介
金额：
$ 1.25万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
财政年份：
2011
资助国家：
日本
起止时间：
2011-08-24 至 2013-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-23870018/
关键词：
繊毛

项目摘要

23年度は磁気ピンセットにより一方向に制御された力を細胞にかけるためには、ノード脇のメカノセンサーと考えられている個々の繊毛に対して少数の磁気ビーズを付着させる試みを行った。磁気ビーズ表面の一部分のみにセンサー繊毛と結合する官能基を修飾し、接着する確率を抑える必要がある。そこで先行研究で報告されているスポットラベル法[Hill et al Biophys. J. 9857-66(2010)]を参考にしてセンサー繊毛に磁気ビーズを付着させることを試みた。表面にStreptavidinを修飾したマイクロ磁気ビーズ(Dynal/Invitrogen社製)をガラス基板上に置き、その上から金をコーティングする。この時ガラス基板の接触しているわずかな表面積を除き、磁気ビーズ表面は金の薄膜でコーティングされる。次にチオール基を持つポリエチレングリコール:Thiol-PEG, Nektar Therapeutics社製)をビーズ表面にコーティングさせることでビーズ表面の一部のみがAvidinを持つ状態となる。ノード繊毛表面はあらかじめbiotinylated wheat-germ agglutinin(b-WGA ; Vector Laboratories, USA)を培養液に混ぜインキュベーションすることでセンサー繊毛表面がBiotinを担持する状態にしておく。ここにAvidin化された磁気ビーズを導入することでAvidin-Biotinの結合力により1本の繊毛限られた少数の磁気ビーズのみを付着させることができる。実験の結果磁気ビーズを接着させることには成功したが予想よりも多くのビーズが付着し凝集してしまい繊毛細胞の性質に影響を与えてしまうこととなった。今後はビーズの最適な濃度の検討し細胞に影響をしない実験条件を探すことが必要となる。なお、本研究課題は24年度の若手Bが採択されたため、途中で辞退することとなった。

在2013财年，为了使用磁力镊子向细胞施加单向控制力，我们尝试将少量磁珠附着到单个纤毛上，纤毛被认为是节点侧面的机械传感器。有必要仅用与传感器纤毛结合的官能团修饰磁珠表面的一部分，以减少粘附的可能性。因此，我们参考之前的研究[Hill et al J. 9857-66 (2010)]中报道的点标记方法，尝试将磁珠附着到传感器纤毛上。将其表面用链霉亲和素修饰的微磁珠(由Dynal/Invitrogen制造)放置在玻璃基板上，并在其顶部涂覆金。此时，除了与玻璃基板接触的小表面积外，磁珠表面都镀有一层金薄膜。接下来，通过用具有硫醇基的聚乙二醇(Thiol-PEG，由Nektar Therapeutics制造)涂覆珠表面，仅珠表面的一部分具有抗生物素蛋白。将生物素化小麦胚芽凝集素（b-WGA；Vector Laboratories，美国）预先混入培养液中并在传感器纤毛表面孵育，使传感器纤毛表面携带生物素。通过在此引入亲和素化磁珠，由于亲和素-生物素的结合力，只能附着仅限于单个纤毛的少量磁珠。实验结果，我们成功附着了磁珠，但附着和聚集的磁珠比预期多，这影响了纤毛细胞的特性。将来，有必要检查珠子的最佳浓度并找到不影响细胞的实验条件。请注意，这个研究项目是2015年青年科学家B选定的，所以我不得不中途退出该项目。