エナメル芽細胞極性化におけるp130Casの機能解明

阐明 p130Cas 在成釉细胞极化中的功能

基本信息

批准号：
22K21017
负责人：
井上茜
金额：
$ 1.83万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-08-31 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K21017/
关键词：
歯エナメル芽細胞分化細胞極性

歯エナメル芽細胞分化細胞極性

项目摘要

エナメル芽細胞はその分化過程において、ダイナミックにその形態を変えながら様々な機能を発揮する細胞であり、それぞれの形態に特有の機能を有するユニークな細胞であると言える。これまでの研究で、細胞接着、細胞骨格の維持および細胞極性などの細胞プロセスに関与することで知られるp130Casに着目し、破骨細胞の骨吸収メカニズムに必須である波状縁の形成に重要であることを発見した。本因子はエナメル芽細胞分化にも影響を与え、細胞極性に重要であることが考えられる。そこで本研究では、p130casを介したエナメル芽細胞分化メカニズムを解析することで、細胞極性による新たな細胞分化制御機構の解明を目的として研究を開始した。本年度は主に、CRIPR/Cas9システムを用いて、p130Cas遺伝子欠損細胞株の樹立を行った。これまでに樹立した、歯原性上皮幹細胞株M3H1を用いて、p130cas遺伝子のexon 2 が欠失したp130遺伝子欠損細胞株を作製した。具体的には、exon 2の両端を特異的に認識する gRNAを作製し、 Cas9タンパク質とともに electroporation 法にて導入を行った。その際、同時にGFP発現ベクターを一過性に遺伝子導入することで、遺伝子導入が成功した細胞の可視化を行った。GFP+ 細胞を、フローサイトメーターを用いて回収し、96well プレートを用いてシングルセル単離培養を行った。シングルセル単離培養にて、クローンの作製に成功した細胞を用いて、western blotting法および免疫染色法を用いてタンパクレベルで p130Casの発現を確認した。p130Cas の発現の消失を認めたクローンをp130 Cas 遺伝子欠損細胞株と定義した。次年度は、本細胞株を用いた機能解析を行う。

搪瓷爆炸是在分化过程中动态改变其形态并发挥各种功能的细胞，可以说是独特的细胞，具有每个形态的功能。先前的研究集中在P130CA上，以参与细胞粘附，细胞骨架维持和细胞极性等细胞过程而闻名，并发现对波浪边缘的形成很重要，这对于破骨细胞的骨吸收机制至关重要。该因素还会影响牙釉质分化，被认为对细胞极性很重要。因此，这项研究开始研究，目的是通过细胞极性通过P130CAS分析牙釉质爆炸的分化机制来阐明牙釉质爆炸分化的机制。今年，我们主要建立了使用CRIPR/CAS9系统缺乏P130CAS基因的细胞系。使用先前建立的牙源性上皮干细胞系M3H1，生成了P130基因缺陷细胞系，其中删除了P130CAS基因的外显子2。具体而言，制备了外显子2的两端的GRNA，并通过电穿孔与Cas9蛋白一起引入并引入。目前，将GFP表达矢量同时转移到可视化成功转移的细胞。使用流式细胞仪收集GFP+细胞，并使用96个井板进行单细胞分离的培养物。在单细胞分离的培养物中，使用蛋白质印迹和免疫染色的细胞用于成功产生克隆的细胞在蛋白质水平上证实P130CA的表达。缺乏P130CAs表达的克隆被定义为缺乏P130CAS基因的细胞系。明年将使用此细胞系进行功能分析。