アルテミシニン耐性原虫封じ込めを可能にするin vitro迅速定量検査法の開発

开发一种能够抑制青蒿素抗性原生动物的体外快速定量检测方法

• 批准号: 18H06149
• 负责人: 池田 美恵
• 金额: $ 1.91万
• 依托单位: Juntendo University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
• 财政年份: 2018
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2018-08-24 至 2020-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18H06149/
• 关键词: アルテミシニン; 核蛍光; ミトコンドリア蛍光; FACS; RSA; 死原虫; アルテミシニン耐性; 熱帯熱マラリア原虫; Pyknotic; 定量検査

本年度は、ウガンダのマラリア感染患者から得た凍結血液検体からの培養株樹立およびマラリア原虫生死判定法の検討を実施した。凍結血液検体は、12% NaCl溶液および1.6% NaCl溶液を用いて解凍した。薄層ギムザ染色標本によって原虫の増殖を確認、原虫感染率1%以上での継代培養が3回以上となった時点で、限界希釈法によってクローン化を実施した。また、ウガンダのアルテミシニン(ART)耐性原虫も同様に解凍し、培養を実施した。耐性原虫はKelch13遺伝子に変異を持っている。この変異をマーカーとして継代中の原虫を確認したところ、ART耐性原虫が減少していくことが分かった。ARTを添加した培養系を用いて耐性原虫のみを得る必要があり、そのための培養系を現在検討している。マラリア原虫生死判定のために、ミトコンドリア蛍光(Mitotracker Red CMXRos）と核蛍光(SYBR Green I)をマーカーとして、Fluorescence activated-cell sorting（FACS)による測定条件の検討を行った。それぞれの蛍光試薬の希釈系列を作成し、非感染赤血球と感染赤血球の測定値の差が最も大きい濃度を最適濃度と設定した。検討の結果、ミトコンドリアでは12.5nM、核では0.0125xの濃度が最適濃度となった。この濃度の有効性をRSAサンプルの生存原虫測定によって検証したところ、FACSでの生存原虫検出率がギムザ染色の1/8-1/16倍であり、FACSの検出率が低かった。原虫のミトコンドリアは発達段階によってサイズが異なり、特に感染初期のearly ring-formではミトコンドリアを十分に染色出来ない可能性が考えられる。ミトコンドリアでの染色条件の検討を続けるとともに死原虫(Pyknotic)核のみをDAPIで検出する方法も検討している。

今年，我们从乌干达疟疾感染患者的冷冻血液样本中建立了培养菌株，并研究了确定疟疾寄生虫活力的方法。使用12% NaCl溶液和1.6% NaCl溶液解冻冷冻血液标本。使用吉姆萨染色的薄标本确认原生动物的增殖，当寄生虫感染率为1%以上且传代培养3次以上时，使用有限稀释法进行克隆。此外，对来自乌干达的青蒿素（ART）抗性原生动物也进行了类似的解冻和培养。抗性原生动物的 Kelch13 基因发生突变。当我们使用这种突变作为标记检查传代过程中的原生动物时，我们发现抗 ART 的原生动物数量正在减少。有必要使用辅以ART的培养系统仅获得抗性原生动物，目前正在考虑用于此目的的培养系统。为了确定疟疾寄生虫是活还是死，我们使用线粒体荧光（Mitotracker Red CMXRos）和核荧光（SYBR Green I）作为标记物，使用荧光激活细胞分选（FACS）研究了测量条件。创建每种荧光试剂的稀释系列，将未感染和感染红细胞测量值差异最大时的浓度设定为最佳浓度。研究结果表明，线粒体的最佳浓度为 12.5nM，细胞核的最佳浓度为 0.0125x。当通过测量RSA样品中的活原虫来验证该浓度的有效性时，FACS对活原虫的检出率是吉姆萨染色的1/8至1/16倍，并且FACS的检出率较低。原生动物的线粒体大小根据发育阶段的不同而变化，线粒体可能无法被充分染色，特别是在感染早期的早期环形中。除了继续检查线粒体的染色条件外，我们还在研究一种使用 DAPI 仅检测死固缩核的方法。

项目成果

ウガンダ北部マラリア原虫集団におけるアルテミシニン耐性レベルの推移

乌干达北部疟原虫种群青蒿素耐药性水平的变化

• 发表时间: 2019
• 作者: 池田 美恵 ;金子 恵 ;橘 真一郎 ;山内 祐人 ;バリカガラ ベティ;江本 桜子 ;福田 直到 ;牧 喜子;森 稔幸 ;平井 誠 ;橋本 宗明 ;カツロ オスベルト ;アウマ マリー;アニワー デニス ;バラクパック ニリアン;片岡 正俊;アギニア エマニュエル;木村 英作;堀井 俊宏 ;美田 敏宏.
• 通讯作者: 美田 敏宏.