ゲノム&RNA編集酵素ADAR1が司るR-loop制御によるゲノム安定性維持機構

由基因组和RNA编辑酶ADAR1控制的R环控制的基因组稳定性维持机制

基本信息

批准号：
18H06054
负责人：
櫻井雅之
金额：
$ 1.91万
依托单位：
Tokyo University of Science
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
财政年份：
2018
资助国家：
日本
起止时间：
2018-08-24 至 2020-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18H06054/
关键词：
ADAR RNA編集アデノシン脱アミノ化 R-loop ゲノム編集

项目摘要

ADAR発現抑制時にRNA:DNA特異的抗体を用いた解析によりRNA:DNA鎖量が増加していることが確認された。新たにFlag-ADAR免疫沈降産物の解析により、RNaseH1, RNaseH2ABC, DHX9, DHX21などRNA:DNA鎖分解酵素や二本鎖を巻き戻すヘリケース群がADARと複合体を形成していることを発見した。RNA:DNA特異的抗体用いた、またはADARを対象とした免疫沈降物から精製したRNA及びDNAの配列解析の結果から、R-loopと思われる領域候補が同定できたが、ノイズの高い問題が避けられないため、追加のR-loop特異的な免疫沈降法による精度向上が必要と判断し、RNA分解能失活変異を導入したFlag-RNaseH2ABC複合体発現系の作製を進めている。他方、培養細胞の表現型としてADAR発現抑制時にはγH2AXだけでなくRPA32やDNA-PKCsのリン酸化状態の上昇が観察され、DNA損傷の増大と修復系の活性化が示された。さらにCyclin B1だけでなく、Histon3、CDC2、PLK1のリン酸化状態の解析結果から、細胞周期のうち、顕著に細胞分裂期における停止しが明らかとし、これら表現型にともなうアポトーシスをPARP1分解の検出により確認した。これらはADARがRNA:DNA鎖量の増加を抑制することを示しており、ADARがR-loopの解消に寄与していると考えられる。さらに、がん細胞はADAR発現抑制時に、抗がん剤かつR-loop増加作用をもつカンプトテシンに対して数百倍の感受性を示して細胞死に至ることを発見した。加えて、ADAR発現抑制とカンプトテシン添加時の細胞周期をフローサイトメトリーにより解析し、細胞分裂期における細胞周期停止を確認した。ADAR発現抑制によるがん細胞のカンプトテシン感受性増強効果を証明した。

使用 RNA:DNA 特异性抗体进行的分析证实，当 ADAR 表达受到抑制时，RNA:DNA 链的数量会增加。通过对 Flag-ADAR 免疫沉淀产物的新分析，我们发现 RNA:DNA 链降解酶（例如 RNaseH1、RNaseH2ABC、DHX9 和 DHX21）以及解旋双链的解旋酶组与 ADAR 形成复合物。根据使用 RNA:DNA 特异性抗体或靶向 ADAR 对从免疫沉淀中纯化的 RNA 和 DNA 进行序列分析的结果，识别出似乎是 R 环的候选区域，但存在高噪音的问题。不可避免的是，我们确定有必要通过使用额外的 R 环特异性免疫沉淀方法来提高准确性，并且我们正在着手创建引入 RNA 降解失活突变的 Flag-RNaseH2ABC 复合表达系统。另一方面，作为培养细胞的表型，当 ADAR 表达受到抑制时，不仅观察到 γH2AX，而且观察到 RPA32 和 DNA-PKC 的磷酸化状态增加，表明 DNA 损伤增加和修复系统激活。此外，对 Cyclin B1 以及 Histon3、CDC2 和 PLK1 的磷酸化状态的分析表明，细胞周期在细胞分裂过程中明显停滞，并且通过检测 PARP1 降解来检测与这些表型相关的细胞凋亡。这些结果表明ADAR抑制RNA:DNA链量的增加，并且认为ADAR有助于R环的解析。此外，他们发现，当 ADAR 表达受到抑制时，癌细胞对喜树碱（一种增加 R 环的抗癌药物，导致细胞死亡）的敏感性提高数百倍。此外，通过流式细胞术分析添加喜树碱后ADAR表达的抑制和细胞周期，并证实细胞周期停滞在细胞分裂阶段。抑制 ADAR 表达对增强癌细胞喜树碱敏感性的作用已得到证实。