センサー細胞を用いた単一細胞の分泌評価システムの開発

使用传感器细胞开发单细胞分泌评估系统

• 批准号: 17H07400
• 负责人: 重藤 元
• 金额: $ 1.91万
• 依托单位: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
• 财政年份: 2017
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2017-08-25 至 2019-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17H07400/
• 关键词: グルカゴン; 生物発光共鳴エネルギー移動(BRET); バイオセンサー; ホモジニアスアッセイ; バイオセンシングプローブ; 糖尿病

本研究課題は膵島細胞の分泌するホルモンなどの血糖値制御因子を、細胞が生きたまま単一細胞レベルで、かつ同時にリアルタイムモニタリングを実現する、単一細胞分泌評価システムを開発することを目的としている。これを実現するためにインスリン、グルカゴン等を標的モデルとした独自のタンパク質プローブを作製し、それらを発現する各種センサー細胞を開発する。平成29年度はグルカゴンを標的とし、グルカゴン受容体の立体構造、標的認識メカニズムを考慮し、タンパク質プローブに使用する部位を選定した。続いて細胞から受容体の構造遺伝子を抽出し、グルカゴン認識に関わると考えられる部位のクローニング並びに遺伝子合成を行った。最後に取得したグルカゴン認識部位とシグナル産生部位である発光タンパク質、蛍光タンパク質を遺伝子工学的に融合し、タンパク質プローブである新規の融合タンパク質を作製した。作製した融合タンパク質のプローブとしての機能を検討するため、標的への結合能の解析を行った。作製した複数の融合タンパク質のグルカゴンに対する結合能を解析したところ、受容体の特定の配列のペアを用いることでBRETシグナルがわずかに上昇することが明らかとなった。このことは、融合タンパク質がグルカゴンと結合し、その結果発光タンパク質と蛍光タンパク質が近接したことに起因するBRETが発生している可能性が高いと考えられる。しかしそのBRET効率はわずかであったことから、今後BRET効率の上昇、検出感度の向上を目指してさらなる改良を行っていく計画である。さらに開発したタンパク質プローブを発現するセンサー細胞の開発と細胞チップの開発を行い、単一細胞分泌評価システムの構築を進める。

该研究项目的目的是开发一种单细胞分泌评估系统，可以在细胞存活时在单细胞水平上同时实时监测血糖控制因素，例如胰岛细胞分泌的激素。是。为了实现这一目标，我们将创建针对胰岛素、胰高血糖素等的独特蛋白质探针，并开发表达它们的各种传感器细胞。 2017财年，我们以胰高血糖素为靶点，通过考虑胰高血糖素受体的三维结构和目标识别机制，选择了用作蛋白质探针的位点。接下来，从细胞中提取受体的结构基因，克隆被认为参与胰高血糖素识别的位点并合成基因。最后，通过对获得的胰高血糖素识别位点和信号产生位点（发光蛋白和荧光蛋白）进行基因工程改造，创建了一种新的融合蛋白，即蛋白质探针。为了研究所制备的融合蛋白作为探针的功能，我们分析了其与靶标结合的能力。对所创建的多种融合蛋白的胰高血糖素结合能力的分析表明，使用一对特定的受体序列会稍微增加 BRET 信号。这表明BRET很可能是由于融合蛋白与胰高血糖素结合，导致发光蛋白和荧光蛋白接近而发生的。然而，由于BRET效率很小，我们计划在未来进一步改进，以提高BRET效率和检测灵敏度。此外，我们将开发表达所开发的蛋白质探针的传感器细胞和细胞芯片，并着手构建单细胞分泌评估系统。

项目成果

ホモジニアスアッセイ型タンパク質プロ―ブを用いたインスリン分泌応答の自己フィードバック効果解析法

使用均相测定蛋白探针的胰岛素分泌反应的自反馈效应分析方法

• 发表时间: 2017
• 作者: 舟橋久景;重藤元;小野拓人;石田丈典;池田丈;廣田隆一;黒田章夫
• 通讯作者: 黒田章夫

1細胞マイクロアレイチップによる各種がん細胞の分離、解析、回収技術

使用单细胞微阵列芯片分离、分析和回收各种癌细胞的技术

• 发表时间: 2017
• 作者: 山村昌平;山田恵理子;木村蕗子;宮島久美子;重藤元
• 通讯作者: 重藤元

細胞・生体分子の固定化と機能発現

细胞/生物分子的固定化和功能表达

• 发表时间: 2018
• 作者: 飯嶋益巳;黒田俊一
• 通讯作者: 黒田俊一

1細胞マイクロアレイチップによる浮遊性および接着性細胞の分離、解析、回収技術

使用单细胞微阵列芯片分离、分析和回收浮游和贴壁细胞技术

• 发表时间: 2017
• 作者: 山村昌平;山田恵理子;木村蕗子;宮島久美子;重藤元
• 通讯作者: 重藤元

1細胞マイクロアレイチップを用いた各種細胞の分離、解析、回収

使用单细胞微阵列芯片分离、分析和收集各种细胞

• 发表时间: 2017
• 作者: 山村昌平;山田恵理子;木村蕗子;宮島久美子;重藤元
• 通讯作者: 重藤元