Establishment of Reverse Genetics in Medaka : Screening for Induced Point Mutations in Medaka with TILLING

青鳉反向遗传学的建立：用 TILLING 筛选青鳉诱导点突变

基本信息

批准号：
16201011
负责人：
TODO Takeshi
金额：
$ 31.2万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

One of the most important tools in biological research is mutational analysis. Our understanding of the basic mechanism of disease has been transformed by the systematic application of mutational analysis. One of the most widely used approaches is forward genetics, which is driven by the identification of mutant phenotypes. Another approach is reverse genetics. The most widely used reverse genetics method in zebrafish and Medaka is undoubtedly the use of morpholinos, but this method is not a substitute for mutations because it is a transient method and only suited for early developmental stages. Recently a general reverse genetics method was reported, which can identify mutations in genes that are known only by their sequence. The method, called TILLING (Targeting Induced Local Lesions IN Genome), includes random mutagenesis, followed by screening for induced mutations in target genes at the genomic DNA level. We have applied this method for establishment of reverse genetics in Medaka. Adult Cab male Medaka were mutagenized with ENU and then outcrossed with Cab female to generate F1 progeny for the library. We established 5771 ENU-mutagenized F1 male fishes. To construct a library, genomic DNA and testis samples were isolated and cryopreserved from each F1 fish. Screening for mutations was done using TGCE (Temperature Gradient Capillary electrophoresis). A pilot screening revealed that the average per-base mutation frequency was 1 in 350kbp. Rev1 protein is an essential player in the production of both spontaneous and DNA damage-induced mutations. We have identified 16 mutations in Rev1 gene, which include 2 nonsense and 14 missense mutations.

生物学研究中最重要的工具之一是突变分析。突变分析的系统应用改变了我们对疾病基本机制的理解。最广泛使用的方法之一是正向遗传学，它是由突变表型的识别驱动的。另一种方法是反向遗传学。在斑马鱼和青鳉中使用最广泛的反向遗传学方法无疑是吗啉代的使用，但这种方法不能替代突变，因为它是一种短暂的方法，仅适用于早期发育阶段。最近报道了一种通用的反向遗传学方法，该方法可以识别仅通过序列已知的基因突变。该方法称为 TILLING（基因组中靶向诱导局部损伤），包括随机诱变，然后在基因组 DNA 水平上筛选靶基因中的诱导突变。我们已应用这种方法在青鳉中建立反向遗传学。成年 Cab 雄性青鳉用 ENU 诱变，然后与 Cab 雌性异型杂交，为文库产生 F1 后代。我们培育了 5771 条 ENU 诱变的 F1 雄性鱼。为了构建文库，从每条 F1 鱼中分离并冷冻保存基因组 DNA 和睾丸样本。使用TGCE（温度梯度毛细管电泳）进行突变筛选。初步筛选显示，平均每个碱基突变频率为 350kbp 中 1 个。 Rev1 蛋白在自发突变和 DNA 损伤诱导突变的产生中发挥重要作用。我们在Rev1基因中鉴定出16个突变，其中包括2个无义突变和14个错义突变。

项目成果

期刊论文数量（141）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

Determination of the g-matrix orientation in flavin radicals by high-field/high-frequency eleron-nuclear double resonance.

通过高场/高频电子-核双共振测定黄素自由基中的 g 基质取向。

DOI：
发表时间：
2005
期刊：
Magn Reson Chem 43
影响因子：
0
作者：
Soejima;H.;et al.;Kay CW
通讯作者：
Kay CW

Investigation of the CPD photolyase DNA recognition mechanism by NMR analyses

通过 NMR 分析研究 CPD 光解酶 DNA 识别机制

DOI：
发表时间：
2004
期刊：
J Biol Chem 279
影响因子：
0
作者：
Nishida;S.;et al.;T.Tgrizawa
通讯作者：
T.Tgrizawa

共振拉曼光谱揭示环丁烷嘧啶二聚体(CPD)光解酶和(6-4)光解酶的异同：FAD辅因子到紫外损伤DNA的电子转移机制

DOI：
发表时间：
2006
期刊：
J Biol Chem 281
影响因子：
0
作者：
Minami;H.;K.Sasa et al.;Li J
通讯作者：
Li J

ショウジョウバエDNA polymerase Y ファミリーの機能解析

果蝇DNA聚合酶Y家族的功能分析

DOI：
发表时间：
2005
期刊：
影响因子：
0
作者：
Furutani-Seiki M;Todo T;et al.;Kamei Y.;Todo T;藤堂剛;石川智子;亀井保博;藤堂剛;藤堂剛;亀井保博;藤堂剛;Ishikawa T;Schleicher E;Todo T;Todo T;藤堂剛;藤堂剛;冨田純也
通讯作者：
冨田純也

Identification of cryptochrome DASH from vertebrates