DNAヘリカーゼを用いた哺乳類細胞のDNA複製の研究

使用 DNA 解旋酶研究哺乳动物细胞中的 DNA 复制

基本信息

批准号：
07672347
负责人：
榎本武美
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07672347/
关键词：
DNAヘリカーゼB ヘリカーゼモチーフ RecD DNA複製哺乳類細胞 cell-free DNA複製系

项目摘要

本研究は哺乳類細胞のDNA複製に関与するDNAヘリカーゼを同定し、このヘリカーゼをプローブにして哺乳類細胞のDNA複製を解析することを目的としたものである。我々は、DNA複製の温度感受性変異株を分離し解析することにより、DNAヘリカーゼBがDNA複製に関与するDNAヘリカーゼであることを示唆してきた。本研究で、DNAポリメラーゼα-プライマーゼ複合体のプラーマ-ゼ活性に及ぼすDNAヘリカーゼBの影響を調べたところ、DNAヘリカーゼBがプライマーゼ活性を顕著にすることが観察され、DNAヘリカーゼBが原核細胞やウイルスのDNA複製に関与するDNAヘリカーゼと同様な作用をすることが明らかになった。さらに、cell-freeのDNA複製系を用いて、この系で機能するDNAヘリカーゼを検討したところ、調べた哺乳類細胞のDNAヘリカーゼのうち唯一、DNAヘリカーゼBのみがこの系で機能することが明らかになった。このように、機能の面からも、DNAヘリカーゼBがDNA複製に関与するDNAヘリカーゼであることを示すことができた。さらに、DNAヘリカーゼBのcDNAのクローニングを試み、cDNAの全長をクローニングすることができた。ホモロジー検索の結果、DNAヘリカーゼBは大腸菌のRecD蛋白とホモロジーの高いヘリカーゼモチーフをもつことが明らかになった。このような蛋白の遺伝子が単離されたのは真核細胞では初めてのことである。この遺伝子によりコードされるアミノ酸配列からDNAヘリカーゼBに結合する抗体も作製することができた。今後、このcDNAを用いてtwo-hybrid systemによりDNAヘリカーゼBと相互作用する蛋白を検索したり、作製した抗体を用いることにより、哺乳類細胞のDNA複製機構やその開始機構を解析していく予定である。

本研究的目的是鉴定哺乳动物细胞中参与DNA复制的DNA解旋酶，并使用该解旋酶作为探针来分析哺乳动物细胞中的DNA复制。通过分离和分析温度敏感的DNA复制突变体，我们提出DNA解旋酶B是参与DNA复制的DNA解旋酶。在本研究中，我们研究了DNA解旋酶B对DNA聚合酶α-引物酶复合物的螺旋酶活性的影响，发现DNA解旋酶B显着增加了引物酶活性，并且DNA解旋酶B已被揭示具有与DNA解旋酶类似的作用，参与细胞和病毒中的DNA复制。此外，当我们使用无细胞DNA复制系统研究在该系统中发挥作用的DNA解旋酶时，我们发现在所研究的哺乳动物细胞DNA解旋酶中，只有DNA解旋酶B在该系统中发挥作用。通过这种方式，我们能够从功能角度证明DNA解旋酶B是参与DNA复制的DNA解旋酶。此外，我们尝试克隆DNA解旋酶B的cDNA并且能够克隆全长cDNA。同源性搜索显示DNA解旋酶B具有与大肠杆菌RecD蛋白高度同源的解旋酶基序。这是首次在真核细胞中分离出这种蛋白质的基因。与 DNA 解旋酶 B 结合的抗体也可以由该基因编码的氨基酸序列产生。未来，我们计划利用该cDNA通过二杂交系统寻找与DNA解旋酶B相互作用的蛋白质，并使用我们创建的抗体来分析哺乳动物细胞中的DNA复制机制及其启动机制。