オステオポンチン遺伝子導入トランスジェニックマウスの解析

骨桥蛋白基因转基因小鼠分析

基本信息

批准号：
07671987
负责人：
池田通
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Showa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07671987/
关键词：
オステオポンチントランスジェニックマウス遺伝子導入

项目摘要

【目的】骨基質蛋白のひとつであるosteopontinはその生理機能がまだ不明であるが、RGD配列を有することから、細胞接着機能を介して骨代謝に影響をおよぼしている可能性が考えられている。我々はin situ hybridizationにより、成熟骨組織では骨芽細胞ではなく、破骨細胞を含む骨吸収系の細胞でosteopontin遺伝子が発現していることを以前確認した。このことは、osteopontinが骨吸収に関与していることを示唆しているが、今回in vivoでのosteopontinの機能を明らかにする目的で、マウスosteopontinを過剰発現するトランスジェニックマウスを作製し、解析した。【方法】マウスosteopontinのcDNAをcytomegalovirus enhancer/chick β-actin promoterと融合させたtransgeneを、C57BL/6N x B6C3F1マウスの受精卵核内にmicroinjectionしてトランスジェニックマウスを作出した。これらのトランスジェニックマウスより得られたF1およびF2マウスを用いて、Northern hybridization, in situ hybridization, 抗osteopontin抗体を用いた免疫組織化学染色、tartrate resistant acid phosphatase (TRACP)活性染色、hematoxylin-eosin染色をおこなった。【結果】得られた15ラインのトランスジェニックマウスについてNorthern hybridizationをおこなったところ、11ラインはtransgeneの発現を認めたが、ライン間で発現レベルおよび発現臓器は異なっていた。また、骨組織を含む主要臓器で比較的高い発現を示した4ラインのF1マウスでは、発育遅延をきたした小型の個体が出現し、そのうちのひとつのラインでは、そのhomozygoteのF2マウスでほぼ全例に小型化を認めた。また、上記4ラインの骨組織の組織学的解析をおこなったところ、一次海綿骨梁およびTRACP陽性細胞の著明な減少が認められた。さらに抗osteopontin抗体を用いた免疫組織化学染色では、Northern hybridizationやin situ hybridizationの結果とは異なり、ほぼ骨組織特異的に蛋白が認められた。【考察】一次海綿骨梁が減少している原因として骨の形成不全または骨吸収の亢進が考えられるが、全身的な発育不全を伴っていたことおよび、TRACP陽性細胞が著明に減少していたことから、骨形成過程に異常があることが考えられた。トランスジェニックマウスにおいてTRACP細胞が著明に減少していた理由は不明であるが、現在各週齢のマウスを用いて骨組織の異常がいつ発現するかについて検討中であり、こらによりある程度原因が類推できるものと思われる。また、osteopontinのmRNAと蛋白の局在とに異なる部分が認められたことについては、詳細を明らかにすべく、現在Western blottingをおこなって比較検討中である。

[目的] 骨桥蛋白是一种骨基质蛋白，其生理功能尚不清楚，但由于其具有RGD序列，因此认为其可能通过其细胞粘附功能影响骨代谢。我们之前通过原位杂交证实骨桥蛋白基因不在成骨细胞中表达，而是在骨吸收谱系的细胞中表达，包括成熟骨组织中的破骨细胞。这表明骨桥蛋白参与骨吸收。为了阐明骨桥蛋白在体内的功能，我们创建并分析了过度表达小鼠骨桥蛋白的转基因小鼠。 [方法]将小鼠骨桥蛋白cDNA与巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白启动子融合的转基因显微注射到C57BL/6N x B6C3F1小鼠的受精卵核中，产生转基因小鼠。使用从这些转基因小鼠获得的F1和F2小鼠进行Northern杂交、原位杂交、使用抗骨桥蛋白抗体的免疫组织化学染色、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)活性染色和苏木精-伊红染色。 [结果]对获得的15个系转基因小鼠进行Northern杂交，发现11个系表达转基因，但各系之间的表达水平和表达器官不同。此外，在包括骨组织在内的主要器官中表现出相对较高表达的四个F1小鼠品系中，出现了发育迟缓的小个体，并且在其中一个品系中，几乎所有的纯合子F2小鼠都出现了小型化。。此外，当对上述四个系的骨组织进行组织学分析时，观察到原代松质小梁和TRACP阳性细胞显着减少。此外，与Northern杂交和原位杂交的结果不同，使用抗骨桥蛋白抗体的免疫组织化学染色揭示了一种几乎对骨组织具有特异性的蛋白质。 [讨论] 原发松质骨小梁的减少被认为是由于骨发育不全或骨吸收增加引起的，但同时伴有全身生长障碍，并且TRACP阳性细胞明显减少，因此认为存在这种情况。是骨形成过程中的异常。转基因小鼠中TRACP细胞显着减少的原因尚不清楚，但我们目前正在使用不同年龄的小鼠研究何时出现骨组织异常，这表明其原因在某种程度上可能是相似的。此外，我们目前正在进行一项使用蛋白质印迹的比较研究，以阐明骨桥蛋白 mRNA 和蛋白质定位差异的细节。