P1ファージ由来組換え酵素導入による条件依存性変異体マウスの作成

通过引入源自 P1 噬菌体的重组酶来创建条件依赖性突变小鼠

基本信息

批准号：
06680839
负责人：
美野輪治
金额：
$ 1.09万
依托单位：
Japanese Foundation For Cancer Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-06680839/
关键词：
標的組換え LoxP Cre酵素 P1ファジ-条件依存性変異 ES再細胞

项目摘要

標的遺伝子組換え法は、ある特定の遺伝子の機能についてin vivoの解析を可能にする有力な方法である。一方多くの遺伝子は、生体の発生・分化の各段階において多様な役割を担っていると考えられ、従来の標的組換え法のみでは、変異体が異常をきたす段階以降については、その解析が不可能である。そこで、標的遺伝子組換え法の応用範囲を拡張し、解析可能なマウスの発生・分化の段階を拡大するために、条件依存性の標的組換え法の開発が必須である。(1)対象遺伝子の検討まずこの方法対象となる遺伝子の検討を行った。我々の研究室で、従来の標的組換え法により既に変異の生殖細胞系列への寄与が確認されているIP3受容体(IP3R),HGF/SF,APCの3種の遺伝子を選んだ。IP3R変異体に関しては、詳細な表現型の解析を現在続行中である。HGF/SFについては、そのホモ接合変異体が、胎生期に胎盤の形成不全のために致死である事を明らかにした。従って、これ以降の発生におけるHGFの機能を明らかにするためには、条件依存性変異体の作製が有効である。またAPC遺伝子については、そのホモ接合変異体が、発生のごく初期、即ち原腸陥入以前に既に致死である事が明らかとなり、同様に条件依存性変異の導入が必須である。(2)APCへの応用まず条件依存性標的組換え法をAPC遺伝子に応用するためにES細胞中での組換え酵素の発現とその効果の検討を行った。APC遺伝子の第14エクソンの上流及び下流の2ヶ所にLoxP配列が挿入した組換えベクターを作製し、これをES細胞に導入して潜在的変異を持つES細胞を得た。ES細胞の中で実際にCre酵素によるLoxP配列の組換えが起こる事を確認するためにCre酵素の発現ベクターを、この潜在的変異を持つES細胞に導入した。PCR法及びサザンブロット法により、APC遺伝子上で目的とするCre酵素による組換えが起きている事を確認した。これらの潜在的変異ES細胞とCre酵素による組換え変異ES細胞両者から、現在ブラストシスト注入法でマウスを作成している。

靶向基因重组是一种强大的方法，可以对特定基因的功能进行体内分析。另一方面，许多基因被认为在生物体发育和分化的各个阶段发挥着多种作用，仅靠常规的靶向重组方法无法分析突变体变得异常的阶段后的情况。因此，为了扩大靶向基因重组方法的应用范围，扩大可分析的小鼠发育和分化阶段，有必要开发条件依赖的靶向重组方法。 (1)目标基因的检查首先，我们检查了该方法所针对的基因。在我们的实验室中，我们选择了三个基因：IP3受体（IP3R）、HGF/SF和APC，使用传统的靶向重组方法已经证实它们的突变对种系有贡献。关于IP3R突变体，详细的表型分析目前正在进行中。关于HGF/SF，我们发现其纯合突变体在胚胎期由于胎盘形成缺陷而致命。因此，为了阐明HGF在后续发育中的功能，创建条件依赖性突变体是有效的。此外，已经清楚的是，APC基因的纯合突变体在发育的早期阶段，即原肠胚形成之前就已经是致命的，并且引入条件依赖性突变也是必要的。 (2)在APC中的应用首先，为了将条件依赖性靶向重组方法应用于APC基因，我们研究了重组酶在ES细胞中的表达及其效果。我们创建了一个重组载体，将LoxP序列插入APC基因第14外显子上游和下游两个位置，并将其导入ES细胞中以获得具有潜在突变的ES细胞。为了确认Cre酶引起的LoxP序列重组确实发生在ES细胞中，将Cre酶的表达载体引入到具有这种潜在突变的ES细胞中。通过PCR和Southern印迹，证实APC基因上发生了所需Cre酶的重组。我们目前正在使用囊胚注射法从这些潜在的突变型 ES 细胞和使用 Cre 酶的重组突变型 ES 细胞中产生小鼠。