P1ファージ由来組換え酵素導入による条件依存性変異体マウスの作成

通过引入源自 P1 噬菌体的重组酶来创建条件依赖性突变小鼠

• 批准号: 06680839
• 负责人: 美野輪 治
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: Japanese Foundation For Cancer Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-06680839/
• 关键词: 標的組換え; LoxP; Cre酵素; P1ファジ-; 条件依存性変異; ES再細胞

標的遺伝子組換え法は、ある特定の遺伝子の機能についてin vivoの解析を可能にする有力な方法である。一方多くの遺伝子は、生体の発生・分化の各段階において多様な役割を担っていると考えられ、従来の標的組換え法のみでは、変異体が異常をきたす段階以降については、その解析が不可能である。そこで、標的遺伝子組換え法の応用範囲を拡張し、解析可能なマウスの発生・分化の段階を拡大するために、条件依存性の標的組換え法の開発が必須である。(1)対象遺伝子の検討 まずこの方法対象となる遺伝子の検討を行った。我々の研究室で、従来の標的組換え法により既に変異の生殖細胞系列への寄与が確認されているIP3受容体(IP3R),HGF/SF,APCの3種の遺伝子を選んだ。IP3R変異体に関しては、詳細な表現型の解析を現在続行中である。HGF/SFについては、そのホモ接合変異体が、胎生期に胎盤の形成不全のために致死である事を明らかにした。従って、これ以降の発生におけるHGFの機能を明らかにするためには、条件依存性変異体の作製が有効である。またAPC遺伝子については、そのホモ接合変異体が、発生のごく初期、即ち原腸陥入以前に既に致死である事が明らかとなり、同様に条件依存性変異の導入が必須である。(2)APCへの応用 まず条件依存性標的組換え法をAPC遺伝子に応用するためにES細胞中での組換え酵素の発現とその効果の検討を行った。APC遺伝子の第14エクソンの上流及び下流の2ヶ所にLoxP配列が挿入した組換えベクターを作製し、これをES細胞に導入して潜在的変異を持つES細胞を得た。ES細胞の中で実際にCre酵素によるLoxP配列の組換えが起こる事を確認するためにCre酵素の発現ベクターを、この潜在的変異を持つES細胞に導入した。PCR法及びサザンブロット法により、APC遺伝子上で目的とするCre酵素による組換えが起きている事を確認した。これらの潜在的変異ES細胞とCre酵素による組換え変異ES細胞両者から、現在ブラストシスト注入法でマウスを作成している。

靶向遗传重组方法是一种强大的方法，可以在体内分析特定基因的功能。另一方面，人们认为许多基因在发育的每个阶段和生物体的分化阶段都扮演着各种各样的角色，并且在仅使用常规靶标重组的突变体异常的阶段后突变体分析是不可能的。因此，必须开发一种依赖条件的靶标重组方法，以扩大目标遗传重组方法的应用范围，并扩大可分析小鼠的发展和分化的阶段。 （1）首先研究靶基因，我们研究了该方法的靶基因。在我们的实验室中，我们选择了三个基因：IP3受体（IP3R），HGF/SF和APC，这些基因已经通过常规的靶向重组方法确认为生殖贡献。对于IP3R突变体，目前正在进行详细的表型分析。对于HGF/SF，发现纯合突变体在胎儿期间由于胎盘发育不良而致死。因此，为了阐明HGF在随后的开发中的功能，依赖条件的突变体的创建是有效的。此外，就APC基因而言，已经揭示了纯合突变体在发育的早期就已经致命，即在胃酸化之前，同样，引入条件依赖性突变是必不可少的。 （2）首先应用于APC，为了将条件依赖性的靶标重组方法应用于APC基因，研究了ES细胞中重组酶的表达及其作用。制备了重组载体，其中将LOXP序列插入了APC基因14外显子上游和下游的两个位置，并将其引入ES细胞中以获得带有潜在突变的ES细胞。为了确认通过CRE酶对LOXP序列的重组实际上发生在ES细胞中，将Cre酶的表达载体引入了带有该潜在突变的ES细胞中。 PCR和Southern印迹证实，与靶Cre酶重组发生在APC基因上。目前，使用来自这些潜在的突变ES细胞的爆炸囊肿注射方法和使用CRE酶的重组ES细胞创建小鼠。