蛋白質の高次構造形成過程をターゲットとしたドミナントネガティブ変異体作成系の確立

建立针对蛋白质高阶结构形成过程的显性失活突变体系统

• 批准号: 04680263
• 负责人: 芝 清隆
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Japanese Foundation For Cancer Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1992
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1992 至 1993
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-04680263/
• 关键词: ドミナントネガティブ; アミノアシルtRNA合成酵素; 折り畳み; 酵素断片; Oct; オクタマー配列; POU転写因子; 転写制御; 転写調節; POU転写調節因子; DNA結合蛋白質; ホメオドメイン; ドミナントネガテイブ; 大腸菌; リプレッサー; 分子遺伝学

本研究は、遺伝情報発現の後期段階をターゲットとした変異体作成技術の確立を、次の2つの実験から目指した。すなわち、1.タンパク質のC末端断片をトランスに供給し、野性型タンパク質の折り畳み反応を阻害する系、および、2.DNA結合タンパク質と標的DNA分子との相互作用を特異的にトランスに抑制する生体物質を選択する系の開発である。研究成果を以下にまとめる。1-(1).イソロイシルtRNA合成酸素C末断片(568-939)を大腸菌内で大量発現し、変性条件で精製した。精製した全長イソロイシルtRNA合成酸素(1-939)をC末断片(568-939)共存下で、試験管内変性・再変性を行うと、C末断片の非存在下に比べ、イソロイシルtRNA合成酸素の活性再構成が著しく阻害された。1-(2). Mycエピトープを付与したC末断片(568-939)を作成し、大腸菌細胞内で発現させた。抗Myc抗体による免疫沈降物を抗イソロイシルtRNA合成酸素抗体を用いてウエスタンブロット解析したところ、全長イソロイシルtRNA合成酸素がC末断片(568-939)と共に、免疫沈降していることがわかった。細胞内で、C末断片が野性型酸素と相互作用していることを証明した2. ラクトースオペロン制御領域のオペレーター部位にOct転写因子標的DNA配列を挿入した改変ラクトースオペロン制御領域をプラスミド上で作成し、これをlambdaファージベクターを用いて大腸菌染色体上に組み込み、Oct転写因子と標的遺伝子の相互作用をモニターする大腸菌試験株を作成した。この試験株は、X-Galを含む寒天培地上で青いコロニーを形成するが、その菌内でOct-3転写因子を発現させると白いコロニーを形成するようになる。プライマー伸長法により、転写開始点を同定し、ノザンブロット実験から、この表現系の変化が転写物の変化と関係していることを確認した。

这项研究旨在从以下两个实验中建立针对遗传信息表达后期的突变体创造技术。即1。向变压器提供蛋白C末端的系统，抑制野生型蛋白的折叠反应，并特别抑制了2.DNA结合蛋白和靶DNA分子之间的相互作用选择一种物质的系统的开发。研究结果总结为下面。 1-（1）。纯化的全长隔离型tRNA合成氧（1-939）在C型片段中共存（568-939）。 1-（2）。分析了通过抗苯基tRNA合成氧抗体免疫的抗MYC抗体，分析了总体长的隔离壳tRNA合成氧与C-末端片段一起免疫（568-939）。在乳糖操纵子控制区域中，在操作员位置中创建了一个修饰的乳糖歌剧控制区域，证明了C端片与野生型氧气相互作用。创建了使用Lambda噬菌体载体的染色体染色体，并创建了Ocinotocci测试，该测试可监视OCT转移因子和靶基因。该测试菌株在含有X-GAL的琼脂培养基上形成蓝色集落，但是当细菌在细菌中表达OCT-3转移因子时，它会形成白色菌落。引物扩展方法确定了转录起点，并确认表达系统的变化与Nozan Brot实验的转录变化有关。

项目成果

ポール・シンメル: "Intron location and functional deletions in relation to the design and evolution of a subgroup of class I tRNA synthetase." Protein Science. 1. 1387-1391 (1992)

Paul Schimmel：“与 I 类 tRNA 合成酶亚组的设计和进化相关的内含子位置和功能缺失。”1. 1387-1391 (1992)。

アリサ・シェパード: "RNA binding determinant in some class I tRNA synthetases identified by alignment-guided mutagenesis." Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 89. 9964-9968 (1992)

Alisa Shepherd：“通过比对引导诱变鉴定出一些 I 类 tRNA 合成酶中的 RNA 结合决定簇。”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89. 9964-9968 (1992)

芝 清隆: "Tripartite functional assembly of a large class I aminoacyl tRNA synthetase." Journal of Biological Chemistry. 267. 22703-22706 (1992)

Kiyotaka Shiba：“大型 I 类氨酰 tRNA 合成酶的三重功能组装。”《生物化学杂志》267。22703-22706（1992）

田浦 徹也: "Insertional disruption of the nusB(ssyB)gene leads to cold-sensitive growth of Escherichia coli and suppression of the secY24 mutation." Mol.Gen.Genet.234. 429-432 (1992)

Tetsuya Taura：“nusB(ssyB) 基因的插入破坏导致大肠杆菌对冷敏感的生长并抑制 secY24 突变。” 429-432 (1992)。

芝 清隆: "Functional assembly of a randomly cleaved protein." Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 89. 1880-1884 (1992)

Kiyotaka Shiba：“随机切割蛋白质的功能组装。”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89。1880-1884（1992）