蛋白質の高次構造形成過程をターゲットとしたドミナントネガティブ変異体作成系の確立

建立针对蛋白质高阶结构形成过程的显性失活突变体系统

基本信息

批准号：
04680263
负责人：
芝清隆
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Japanese Foundation For Cancer Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1992
资助国家：
日本
起止时间：
1992 至 1993
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は、遺伝情報発現の後期段階をターゲットとした変異体作成技術の確立を、次の2つの実験から目指した。すなわち、1.タンパク質のC末端断片をトランスに供給し、野性型タンパク質の折り畳み反応を阻害する系、および、2.DNA結合タンパク質と標的DNA分子との相互作用を特異的にトランスに抑制する生体物質を選択する系の開発である。研究成果を以下にまとめる。1-(1).イソロイシルtRNA合成酸素C末断片(568-939)を大腸菌内で大量発現し、変性条件で精製した。精製した全長イソロイシルtRNA合成酸素(1-939)をC末断片(568-939)共存下で、試験管内変性・再変性を行うと、C末断片の非存在下に比べ、イソロイシルtRNA合成酸素の活性再構成が著しく阻害された。1-(2). Mycエピトープを付与したC末断片(568-939)を作成し、大腸菌細胞内で発現させた。抗Myc抗体による免疫沈降物を抗イソロイシルtRNA合成酸素抗体を用いてウエスタンブロット解析したところ、全長イソロイシルtRNA合成酸素がC末断片(568-939)と共に、免疫沈降していることがわかった。細胞内で、C末断片が野性型酸素と相互作用していることを証明した2. ラクトースオペロン制御領域のオペレーター部位にOct転写因子標的DNA配列を挿入した改変ラクトースオペロン制御領域をプラスミド上で作成し、これをlambdaファージベクターを用いて大腸菌染色体上に組み込み、Oct転写因子と標的遺伝子の相互作用をモニターする大腸菌試験株を作成した。この試験株は、X-Galを含む寒天培地上で青いコロニーを形成するが、その菌内でOct-3転写因子を発現させると白いコロニーを形成するようになる。プライマー伸長法により、転写開始点を同定し、ノザンブロット実験から、この表現系の変化が転写物の変化と関係していることを確認した。

这项研究旨在通过两个实验来建立一种针对遗传信息表达的晚期阶段的突变生产技术：也就是说，它是一个系统的开发，该系统提供了一种供应蛋白质的C末端碎片来转移和抑制野生型蛋白质的折叠反应，并抑制2个。选择的生物学物质，选择了与DNA构成dna corecul corecuul corecul cornecul corecul and tarnecul corecul cornecul cornecul and toction con colcine colecul and toction cons colcine colec and contine con col cons colaine cor colaine cor的相互作用。研究结果总结为下面。 1-（1）。异亮基TRNA合成：氧C末端片段（568-939）在大肠杆菌中广泛表达，并在变性条件下纯化。如果在存在C末端片段（568-939）的情况下，将纯化的全长异氰基糖tRNA合成氧（1-939）在体外重新定性并重新定位时，与C-term-Term-Termerminal extressiment的缺失相比，Isolecyl TRNA-合成氧的主动重新基团受到了显着抑制。 1-（2）。在大肠杆菌细胞中制备并表达了赋予MYC表位的C末端片段（568-939）。当使用抗异戊酸TRNA合成的氧抗体通过蛋白质印迹分析抗MYC抗体免疫沉淀，并发现全长的异亮糖基tRNA合成的氧与C-末端片段（568-939）一起进行了免疫沉淀。 Proveing that C-terminal fragments interact with wild-type oxygen in cells 2. A modified lactose operon control region was created on a plasmid in which the Oct transcription factor target DNA sequence was inserted into the operator site of the lactose operon control region, and this was integrated onto the E. coli chromosome using a lambda phage vector to create an E. coli test strain to monitor the interaction of the Oct transcription factor and the target基因。该测试菌株在含有X-gal的琼脂上形成蓝色菌落，但是当细菌内表达Oct-3转录因子时，它会形成白色菌落。转录起源是通过引物扩展方法鉴定的，北印迹实验证实了表型的这种变化与转录本的变化有关。