カルシウムによる遺伝子転写調節因子のクローニング-細胞内導入及び発現に向けて

通过钙克隆基因转录调节因子 - 向细胞内导入和表达

基本信息

批准号：
04671463
负责人：
岡崎具樹
金额：
$ 1.41万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1992
资助国家：
日本
起止时间：
1992 至 1993
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-04671463/
关键词：
カルシウム転写因子遺伝子発現還元因子(ref1)

项目摘要

生体の細胞外液Ca濃度の恒常性を保つための機構を解明する目的で、外液Ca濃度を感知してnCaREというDNAエレメントを共有する一群の遺伝子の転写を抑制する転写因子を同定した。この核蛋白は、種々の転写因子のDNA結合活性を増強させることが知られていたref1というものであった。しかし、これまで、ref1自体のDNA結合活性については知られていなかった。以下に我々の得た知見を記す。1)大腸菌で大量発現させ精製したref1蛋白は、DNA配列(nCaRE)特異的に結合し、2)ref1発現ベクターを導入した培養細胞の核蛋白とnCaRE結合活性は劇的に増強した。3)ref1 mRNA及び蛋白の量は共に、細胞外液Ca濃度の上昇によって数倍増加した。この上昇は外液Ca濃度上昇による、nCaREに対する核蛋白の結合活性の増強と平行した。4)ref1蛋白は培養細胞において持続的に発現されているため、アンチセンスref1 cDNAをHeLa細胞に導入した。その結果、a)アンチセンスref1 cDNAを導入した細胞(Fer-HeLa)の核蛋白中のref1蛋白量は著減した。b)Fer-HeLa細胞の核蛋白のnCaREに対する結合活性も著減した。c)Fer-HeLa細胞では、細胞外液Ca濃度上昇による転写抑制が消失した。以上の結果から、ref1蛋白は、nCaREに結合することによって、細胞外液Caによる遺伝子転写抑制を媒介することが強く支持された。さらに、ヒトref1蛋白に対する抗ref1抗体を用いた実験によって、5)培養細胞核蛋白とnCaREとの間のゲルシフトアッセイにおいてこの抗体を加えるとnCaRE-核蛋白複合体は、抗体特異的に消失した。そして、抗体を含むこの反応液に、精製ref1蛋白を加えるとnCaRE-核蛋白複合体が元通りに復元された。これらの実験結果から、細胞外液Ca濃度依存性に、nCaREを有する遺伝子の転写抑制に関わる核蛋白(nCaREB)の少なくとも一つがref1蛋白であることが結論された(Prog.in Endocrinology,1993;pp407-410、及び投稿中)。

为了阐明生物中细胞外Ca浓度的稳态的机制，我们确定了一种转录因子，该转录因子检测外部Ca浓度并抑制一组具有DNA元件的基因的转录，该基因共有一个称为NCARE的DNA元件。该核蛋白被称为REF1，已知可以增强各种转录因子的DNA结合活性。但是，到目前为止，REF1本身的DNA结合活性尚不清楚。以下是我们获得的发现。 1）REF1蛋白在大肠杆菌中广泛表达并纯化，特异性与DNA序列（NCARE）结合，以及2）培养的细胞的核蛋白蛋白和NCARE结合活性急剧增加。 3）REF1 mRNA的量和蛋白质的量增加了几倍，随着细胞外液的浓度升高。由于外部液体Ca的浓度升高，这种增加与核蛋白与NCARE的结合活性的增强相似。 4）由于REF1蛋白在培养的细胞中连续表达，因此将反义REF1 cDNA引入HELA细胞中。结果，a）细胞核蛋白（FER-HELA）中的Ref1蛋白量显着降低了反义REF1 cDNA。 b）也显着降低了Fer-Hela细胞中核蛋白与NCARE的结合活性。 c）在Fer-Hela细胞中，消除了由细胞外液体Ca浓度升高引起的转录抑制。从以上结果来看，强烈支持REF1蛋白通过与NCARE结合通过细胞外液CA介导基因转录抑制。此外，使用抗REF1抗体对人REF1蛋白的实验表明，5）当在培养的细胞核蛋白和NCARE之间的凝胶转移测定中添加该抗体时，ncare-核蛋白复合物被特别丢失。然后，当将纯化的REF1蛋白添加到包含抗体的反应溶液中时，将NCARE核蛋白复合物恢复为原始态。这些实验结果得出的结论是，携带NCARE基因转录抑制的至少一种核蛋白（NCAREB）是依赖细胞外液含量Ca浓度的REF1蛋白（Endrinology，1993; PP407-410中的Prog。