カルシウムによる遺伝子転写調節因子のクローニング-細胞内導入及び発現に向けて

通过钙克隆基因转录调节因子 - 向细胞内导入和表达

基本信息

批准号：
04671463
负责人：
岡崎具樹
金额：
$ 1.41万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1992
资助国家：
日本
起止时间：
1992 至 1993
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-04671463/
关键词：
カルシウム転写因子遺伝子発現還元因子(ref1)

项目摘要

生体の細胞外液Ca濃度の恒常性を保つための機構を解明する目的で、外液Ca濃度を感知してnCaREというDNAエレメントを共有する一群の遺伝子の転写を抑制する転写因子を同定した。この核蛋白は、種々の転写因子のDNA結合活性を増強させることが知られていたref1というものであった。しかし、これまで、ref1自体のDNA結合活性については知られていなかった。以下に我々の得た知見を記す。1)大腸菌で大量発現させ精製したref1蛋白は、DNA配列(nCaRE)特異的に結合し、2)ref1発現ベクターを導入した培養細胞の核蛋白とnCaRE結合活性は劇的に増強した。3)ref1 mRNA及び蛋白の量は共に、細胞外液Ca濃度の上昇によって数倍増加した。この上昇は外液Ca濃度上昇による、nCaREに対する核蛋白の結合活性の増強と平行した。4)ref1蛋白は培養細胞において持続的に発現されているため、アンチセンスref1 cDNAをHeLa細胞に導入した。その結果、a)アンチセンスref1 cDNAを導入した細胞(Fer-HeLa)の核蛋白中のref1蛋白量は著減した。b)Fer-HeLa細胞の核蛋白のnCaREに対する結合活性も著減した。c)Fer-HeLa細胞では、細胞外液Ca濃度上昇による転写抑制が消失した。以上の結果から、ref1蛋白は、nCaREに結合することによって、細胞外液Caによる遺伝子転写抑制を媒介することが強く支持された。さらに、ヒトref1蛋白に対する抗ref1抗体を用いた実験によって、5)培養細胞核蛋白とnCaREとの間のゲルシフトアッセイにおいてこの抗体を加えるとnCaRE-核蛋白複合体は、抗体特異的に消失した。そして、抗体を含むこの反応液に、精製ref1蛋白を加えるとnCaRE-核蛋白複合体が元通りに復元された。これらの実験結果から、細胞外液Ca濃度依存性に、nCaREを有する遺伝子の転写抑制に関わる核蛋白(nCaREB)の少なくとも一つがref1蛋白であることが結論された(Prog.in Endocrinology,1993;pp407-410、及び投稿中)。

为了阐明维持生物体细胞外 Ca2+ 浓度稳态的机制，我们鉴定了一种转录因子，它可以感知外部液体 Ca2+ 浓度并抑制一组共享 DNA 元件（称为 nCaRE）的基因的转录。这种核蛋白被称为 ref1，已知它可以增强各种转录因子的 DNA 结合活性。然而，到目前为止，ref1 本身的 DNA 结合活性尚不清楚。我们获得的结果描述如下。 1) 在大肠杆菌中大量表达并纯化的 ref1 蛋白，与 DNA 序列 (nCaRE) 特异性结合，以及 2) 引入 ref1 表达载体的培养细胞的核蛋白和 nCaRE 结合活性得到了显着增强。 3)随着细胞外液Ca浓度的增加，ref1 mRNA和蛋白质的量均增加数倍。这种增加与由于外部液体 Ca 浓度增加而导致的核蛋白与 nCaRE 结合活性的增强是平行的。 4)由于ref1蛋白在培养细胞中持续表达，因此将反义ref1 cDNA引入HeLa细胞中。结果，a)已导入反义ref1 cDNA的细胞(Fer-HeLa)的核蛋白中ref1蛋白的量显着减少。 b) Fer-HeLa细胞核蛋白与nCaRE的结合活性也显着降低。 c) 在Fer-HeLa细胞中，细胞外液Ca浓度增加引起的转录抑制消失。上述结果有力地支持了ref1蛋白通过与nCaRE结合介导细胞外Ca的基因转录抑制。此外，在使用针对人ref1蛋白的抗ref1抗体的实验中，5)当在培养的细胞核蛋白和nCaRE之间的凝胶迁移测定中添加该抗体时，nCaRE-核蛋白复合物以抗体特异性方式消失。当将纯化的ref1蛋白添加到含有抗体的反应溶液中时，nCaRE-核蛋白复合物恢复到其原始状态。从这些实验结果可以得出结论，至少一种以依赖于细胞外液Ca浓度的方式参与nCaRE基因转录抑制的核蛋白(nCaREB)是ref1蛋白(Prog.in Endocrinology，1993；第 407-410 页并正在提交中）。