哺乳動物リバースジェネティクス法を用いたてんかんの候補遺伝子の同定

利用哺乳动物反向遗传学鉴定癫痫候选基因

• 批准号: 14658263
• 负责人: 廣瀬 伸一
• 金额: $ 1.86万
• 依托单位: Fukuoka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14658263/
• 关键词: チャネル; 受容体; トランスジェニックマウス; 実験動物; トランスジェニック

ラットnAChRのα4サブユニット遺伝子Chrna4のcDNAをPCRクローニング法により調整した。続いてヒトのSer284Leu変異の相同変異であるSer284Leu(c.856T> C : c.857C>T)変異をラットChrna4のcDNA (L31620)に導入した。既報のとおり、変異cDNAを用いて、変異ラットnAChRの電気的特性を野生型のそれと比較し、変異α4サブユニットを持つnAChRは野生型のそれに比べ、desensitizationがより急峻になることを確認した。作成した変異cDNAをPDGFプロモーターを持つベクターに移入した後、定法どおりラット受精卵に顕微注入した。仮親の卵管内への移植により、組換体を作出した。組換え遺伝子はラット尾より抽出したゲノムDNAを直接シーククエンスし確認した。組換え遺伝子の発現は、各組織より抽出したトータルRNAを用いたリアルタイムRT-PCRにより評価した。遺伝子組換えラットを2系統得て、うち一系統(S284L-TG)をその後の繁殖および実験に用いた。S284L-TGの妊孕力は野性型のラットと変わらず、出生個体数も変化なかった。また出生仔中の組換え体数もメンデルの法則に矛盾しなかった。S284L-TGでは、c.856T>C:c.857C>T変異を持つmRNAの発現が中枢神経と筋肉を中心に確認された。S284L-TG睡眠中の脳波で頻回の発作波の出現がみとめられた。これに一致し、ADNFLEの発作のひとつであるparoxysmal arousal発作を1日200回程度認めた。また時に一部全般化するmotor attackも認めた。しかしながら、筋力、協調運動,自発運動量、痛み感受性は組換体と組換体の間で差異は認められなかった。さらに、ペンテトラゾール誘発けいれんも、発現までの潜時、さらにけいれんの持続時間に組換体と同胞非組換体の間で変化はなかった。

通过PCR克隆制备大鼠nAChRα4亚基基因Chrna4的cDNA。接下来，将作为人Ser284Leu突变的同源突变的Ser284Leu(c.856T>C：c.857C>T)突变引入大鼠Chrna4 cDNA(L31620)中。正如之前报道的，我们使用突变体 cDNA 比较了突变体大鼠 nAChR 与野生型大鼠 nAChR 的电特性，并证实突变体 α4 亚基对 nAChR 的脱敏作用比野生型更陡峭。将产生的突变体cDNA转移至含有PDGF启动子的载体中，然后根据标准方法显微注射至受精大鼠卵中。重组体是通过将养父母移植到输卵管中产生的。通过对从大鼠尾部提取的基因组DNA进行直接测序来证实重组基因。使用从每个组织中提取的总RNA，通过实时RT-PCR评估重组基因的表达。获得两系转基因大鼠，其中一系（S284L-TG）用于后续饲养和实验。 S284L-TG的生育能力与野生型大鼠相同，活产数也没有变化。此外，后代中重组体的数量并不违反孟德尔定律。在S284L-TG中，确认了c.856T>C:c.857C>T突变的mRNA主要在中枢神经系统和肌肉中表达。 S284L-TG 睡眠期间脑电图观察到频繁的癫痫波。与此相一致的是，阵发性唤醒发作（ADNFLE 发作之一）每天观察到大约 200 次。还观察到有时会变得普遍的运动攻击。然而，重组植物和重组植物之间的肌肉力量、协调性、运动活性和疼痛敏感性没有观察到差异。此外，重组和非重组同胞之间，戊四唑诱导的惊厥发作潜伏期或惊厥持续时间没有变化。

项目成果

Matsushima N., et al.: "Mutation (Ser284Leu) of neuronal nicotinic acetylcholine receptor α4 subunit associated with frontal lobe epilepsy causes faster desensitization of the rat receptor expressed in oocyte"Epilepsy Res. 48. 181-186 (2002)

Matsushima N. 等人：“与额叶癫痫相关的神经元烟碱乙酰胆碱受体 α4 亚基的突变 (Ser284Leu) 导致卵母细胞中表达的大鼠受体更快脱敏”Epilepsy Res. 48. 181-186 (2002)

Protein kinase associated with gating and closing transmission mechanisms in temporoammonic pathway.

与颞氨途径中的门控和关闭传递机制相关的蛋白激酶。

• 发表时间: 2004
• 期刊: Neuropharmacology 47・4
• 作者: Okada M et al.;Nakatsu F. et al.;Okada M. et al.
• 通讯作者: Okada M. et al.

Determination of exocytosis mechsnisms of DOPA in rat striatum using in vivo microdialysis.

使用体内微透析测定大鼠纹状体中多巴的胞吐机制。

• 发表时间: 2004
• 期刊: Neurosci Lett 367
• 作者: Gang Zhu.;et al.
• 通讯作者: et al.

Seven Myoclonic Epilepsy in Infants - Clinical analysis and relation to SCN1A mutations -

七种婴儿肌阵挛性癫痫 - 临床分析及其与 SCN1A 突变的关系 -

• 发表时间: 2005
• 期刊: Adv Nerol 95
• 作者: Oguni H.;et al.
• 通讯作者: et al.

Kaneko S., et al.: "Genetics of epilepsy : current status and perspectives"Neurosci Res. 44. 11-30 (2002)

Kaneko S. 等人：“癫痫遗传学：现状和观点”Neurosci Res。