自己肝細胞と3次元胆管ネットワークを用いた再生肝の構築

利用自体肝细胞和3D胆管网络构建再生肝脏

基本信息

批准号：
14657286
负责人：
森正樹
金额：
$ 2.05万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

项目摘要

1.ヒト肝前駆細胞(oval cell, small hepatocyte)の単離・培養系の確立すでにヒト肝前駆細胞をヒト組織より単離し、培養する手法を試みている。単離には磁気カラムとセルソーターを併用すると共に、細胞種特異的なリガンドを固定化したカラム、培養表面を作製し、単離効率が向上した。新型セルソーターの導入によりSP系細胞の分離・回収能が一段と向上したため、現在ヒト肝前駆細胞の表面マーカーフェノタイプの確立を行っている。これによりマーカー抗体が確定すると、分離技術が更に向上する。2.マウスの肝細胞における、マイクロアレイ遺伝子発現解析本年度は肝幹細胞の遺伝子発現レベルにおける特徴を調べる研究を行った。雄性C57/BL6マウスにHiggins & Andersonの2/3肝切除を施行し、実験的肝切除モデルをマウスで作成し、2、6、24時間と3、7日後にそれぞれ、sham operation群1頭と肝切除群3頭より残肝(再生肝)、膵臓、血液を採取。Agilentのマウス用cDNAマイクロアレイ(8,737遺伝子)を用いて遺伝子発現プロファイルの経時的変化を肝臓、膵臓それぞれで解析した。その結果(1)肝切除術後何れかの時点で4倍以上の発現増強または1/4以下の減弱を認めたのは473遺伝子。(2)肝切除群での経時発現量の変化がsham手術群でのそれと同程度である遺伝子や多峰性を示す遺伝子を除き、肝再生に伴い特異的に変化する162遺伝子を選別した。内訳は2,6,24時間,3,7日目の順に、17,28,37,27,23の計132遺伝子が4倍以上増強、また、4,13,25,6の計30遺伝子が1/4以下に減弱した。(3)肝再生における開始シグナルの候補として、2,6時間後にインターフェロンγ誘導遺伝子、platelet factor 4、procollagen type V、転写因子(NF-1)、増殖因子(FGF)等の増強が見られた。24時間後には、イノスリン受容体、アポトーシス関連遺伝子等の増強、3日後にはG蛋白αs、転写因子(SIN3B)、toll-like receptor-1の増強を認めた。肝再生の終息シグナルの候補として、24時間後には細胞分化因子(tryptophan 2,3-dioxygenase)の増強、3日後にはaxinの増強、癌遺伝子(RAB18)の減弱等が抽出された。3.再生担体としての3次元モデル再生担体としての3次元モデルとして「東洋紡」による中空ファイバーモデルが現時点では最適の実験モデルであると考えられたため、これを用いた再生肝細胞実験を開始している。中空糸の膜厚が50ミクロンと大きいため、液性因子の疎通性がよくないため、改良を試みたが現在のところ不十分である。他社の中空糸モデルを試みているところである。

1。建立用于椭圆形细胞（小肝细胞）的隔离和培养系统，我们已经尝试了分离和培养人肝脏祖细胞与人体组织的方法。为了隔离，将磁柱和细胞分辨率组合使用，制备了柱和培养表面，其中固定了细胞类型特异性配体，从而提高了分离效率。新细胞分类器的引入进一步提高了基于SP的细胞的分离和恢复能力，目前正在建立人肝脏祖细胞的表面标记表型。当确认标记抗体时，这进一步改善了分离技术。 2。今年小鼠肝细胞中的微阵列基因表达分析，我们进行了一项研究，以研究肝干细胞基因表达水平的特征。对Higgins＆Anderson的2/3肝切除进行了雄性C57/BL6小鼠，并在小鼠中创建了实验性肝切除模型，在2、6、6、24小时，3和7天后，剩余的肝（再生肝），胰腺和血液从一个Sham操作组和三个Sham Sham Slurred Hepatic切除组中收集。使用Agilent的小鼠cDNA微阵列（8,737个基因）分析了肝脏和胰腺的基因表达谱的变化。结果，（1）473个基因的表达增加了超过四倍或更少的肝切除术后时间点的衰减至少四分之一。（2）选择了特异性地使用肝切除的162个基因，除了表达水平与假手术组和表现出多模式的基因相同的基因。分解以2、6、24小时，3和7天的顺序进行，总共132个基因，17、28、37、27和23，总共30个基因，4、13、25和6，衰减至1/4。（3）在2或6小时后，观察到了干扰素γ诱导基因，血小板因子4，procollagen型V，转录因子（NF-1），生长因子（FGF）和其他因子，作为肝脏再生中启动信号的候选者。 24小时后，增强了Innosulin受体和与凋亡相关的基因，3天后，G蛋白αs，转录因子（SIN3B）和TOLL样受体1增强了。 24小时后，提取了用于结束肝脏再生的候选信号作为增强细胞分化因子（色氨酸2,3-二加氧酶）的增强，轴突增强和癌基因的衰减（RAB18）3天后。 3D模型作为再生载体作为3D模型作为再生载体，Toyobo的中空纤维模型被认为是最佳的实验模型，因此我们开始使用此尝试尝试使用再生肝细胞进行实验。由于空心纤维的厚度在50微米时很大，因此液体因子通信较差，因此尝试了改进，但到目前为止还不够。我们目前正在尝试其他公司的空心纤维型号。