自己肝細胞と3次元胆管ネットワークを用いた再生肝の構築

利用自体肝细胞和3D胆管网络构建再生肝脏

基本信息

批准号：
14657286
负责人：
森正樹
金额：
$ 2.05万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

项目摘要

1.ヒト肝前駆細胞(oval cell, small hepatocyte)の単離・培養系の確立すでにヒト肝前駆細胞をヒト組織より単離し、培養する手法を試みている。単離には磁気カラムとセルソーターを併用すると共に、細胞種特異的なリガンドを固定化したカラム、培養表面を作製し、単離効率が向上した。新型セルソーターの導入によりSP系細胞の分離・回収能が一段と向上したため、現在ヒト肝前駆細胞の表面マーカーフェノタイプの確立を行っている。これによりマーカー抗体が確定すると、分離技術が更に向上する。2.マウスの肝細胞における、マイクロアレイ遺伝子発現解析本年度は肝幹細胞の遺伝子発現レベルにおける特徴を調べる研究を行った。雄性C57/BL6マウスにHiggins & Andersonの2/3肝切除を施行し、実験的肝切除モデルをマウスで作成し、2、6、24時間と3、7日後にそれぞれ、sham operation群1頭と肝切除群3頭より残肝(再生肝)、膵臓、血液を採取。Agilentのマウス用cDNAマイクロアレイ(8,737遺伝子)を用いて遺伝子発現プロファイルの経時的変化を肝臓、膵臓それぞれで解析した。その結果(1)肝切除術後何れかの時点で4倍以上の発現増強または1/4以下の減弱を認めたのは473遺伝子。(2)肝切除群での経時発現量の変化がsham手術群でのそれと同程度である遺伝子や多峰性を示す遺伝子を除き、肝再生に伴い特異的に変化する162遺伝子を選別した。内訳は2,6,24時間,3,7日目の順に、17,28,37,27,23の計132遺伝子が4倍以上増強、また、4,13,25,6の計30遺伝子が1/4以下に減弱した。(3)肝再生における開始シグナルの候補として、2,6時間後にインターフェロンγ誘導遺伝子、platelet factor 4、procollagen type V、転写因子(NF-1)、増殖因子(FGF)等の増強が見られた。24時間後には、イノスリン受容体、アポトーシス関連遺伝子等の増強、3日後にはG蛋白αs、転写因子(SIN3B)、toll-like receptor-1の増強を認めた。肝再生の終息シグナルの候補として、24時間後には細胞分化因子(tryptophan 2,3-dioxygenase)の増強、3日後にはaxinの増強、癌遺伝子(RAB18)の減弱等が抽出された。3.再生担体としての3次元モデル再生担体としての3次元モデルとして「東洋紡」による中空ファイバーモデルが現時点では最適の実験モデルであると考えられたため、これを用いた再生肝細胞実験を開始している。中空糸の膜厚が50ミクロンと大きいため、液性因子の疎通性がよくないため、改良を試みたが現在のところ不十分である。他社の中空糸モデルを試みているところである。

1、人肝祖细胞（卵圆细胞、小肝细胞）分离培养体系的建立我们已经在尝试从人体组织中分离培养人肝祖细胞。通过使用磁柱和细胞分选仪的组合，以及创建固定有细胞类型特异性配体的柱和培养表面，提高了分离效率。随着新型细胞分选仪的推出，分离和回收SP细胞的能力得到进一步提高，目前我们正在建立人肝祖细胞的表面标记表型。一旦确定了标记抗体，分离技术将进一步改进。 2.小鼠肝细胞中基因表达的微阵列分析今年，我们进行了研究，以了解肝干细胞中基因表达水平的特征。 Higgins & Anderson 对雄性 C57/BL6 小鼠进行 2/3 肝切除，建立小鼠实验性肝切除模型，并于 2、6、24 小时、3、7 天后，假手术组一只小鼠和一只小鼠对假手术组的动物进行处理，从肝脏切除组的3只狗中收集残肝（再生肝）、胰腺和血液。使用安捷伦的小鼠 cDNA 微阵列（8,737 个基因），我们分别分析了肝脏和胰腺中基因表达谱的时间变化。结果，(1)473个基因在肝切除后的某个时刻表现出4倍以上的表达增强或1/4以下的表达减弱。 (2)我们选择了162个随着肝再生发生特异性变化的基因，排除了肝切除组中随着时间的推移表达水平与假手术组相似的基因以及表现出多模态的基因。共有132个基因（17、28、37、27、23）按2、6、24小时、3、7天的顺序增加了4倍以上，共有30个基因（4、13）增加了4倍以上。、25和6）增加到不足1/4。 (3)作为肝再生起始信号的候选者，在2和6后观察到干扰素γ诱导基因、血小板因子4、V型前胶原、转录因子(NF-1)、生长因子(FGF)等的增强小时。 24小时后，观察到肌胰岛素受体和凋亡相关基因的增强，3天后，观察到G蛋白α、转录因子(SIN3B)和Toll样受体-1的增强。作为肝再生终止信号的候选，提取了24小时后细胞分化因子(色氨酸2,3-双加氧酶)的增强、3天后轴蛋白的增强以及癌基因(RAB18)的减弱。 3. 3D模型作为再生载体作为3D模型作为再生载体，东洋纺的中空纤维模型被认为是目前最合适的实验模型，因此我们开始利用该模型进行肝细胞的再生实验。中空纤维的膜厚达50微米，因此流体因子不具备良好的渗透性，因此曾尝试对其进行改进，但迄今为止还不够。我们目前正在尝试另一家公司的中空纤维模型。