PETを用い生体で遺伝子発現をリアルタイムにイメージングする方法の開発

开发使用 PET 实时成像活体基因表达的方法

• 批准号: 14657161
• 负责人: 前村 浩二
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14657161/
• 关键词: PET; レポーター; 低酸素; HIF-1; トランスジェニックマウス; エンハンサー; 動脈硬化; 心筋梗塞

HSV-tkはその特異的な基質であるFIAUと反応し、細胞内に取り込む働きを有している。そこで^<124>IでラベルしたFIAUを投与しPETにより画像化することで、HSV-tkの発現する細胞を可視化できる。この原理を利用し、HSV-tkをreporter geneとしPETによりイメージングすることにより、生体動物内における遺伝子発現をリアルタイム評価することが期待できる。本研究は、虚血に陥った組織をPETを用いて生きたままリアルタイムに観察する手法を開発することを目的として遂行した。低酸素状態において、細胞内では転写因子HIF-1が著明に活性化されて核内に移行し、HIF-1結合部位と呼ばれるシスエレメントに結合し遺伝子発現を誘導する。そこで、このHIF-1結合部位をtandemに結合したエンハンサー配列をルシフェラーゼレポーターの上流に結合したコンストラクトを作成した。このコンストラクトをNIH3T3細胞にトランスフェクションし、1%の低酸素状態で培養すると、約10倍にルシフェラーゼ活性が上昇し、このエンハンサー配列が低酸素に反応することが確認された。次にこのエンハンサー配列をHSV-tk遺伝子の上流に結合したコンストラクトを作成し低酸素によりHSV-tkが誘導されることを、in vitroで確認した。その後、このコンストラクトをマウス受精卵にmicroinjectionし、トランスジェニックマウスを作成中である。今後樹立されたトランスジェニックマウスを用いてPETによる画像化を行う予定である。さらに動脈硬化、心筋梗塞モデルを作成し、PETによる虚血部位の観察、さらには虚血を改善する薬剤のスクリーニングを行う予定である。本研究は、低酸素に反応するエンハンサー部位の決定、トランスジェニックマウス用の今ストラクトの作成までは順調にいったものの、トランスジェニックマウスの作成に時間を要したため、1年間ではPETによりin vivoでのシグナルを観察するまでには至らなかった。しかし、計画した実験自体は予定通り進行しているため、近日中にPETによる観察が可能になるものと期待される。

HSV-tk具有与其特异性底物FIAU发生反应并将其带入细胞内的功能。因此，可以通过施用用 124 I标记的FIAU并通过PET成像来使表达HSV-tk的细胞可视化。通过利用这一原理并使用 HSV-tk 作为报告基因进行 PET 成像，预计可以实时评估活体动物中的基因表达。本研究的目的是开发一种使用 PET 实时观察还活着的缺血组织的方法。在缺氧条件下，转录因子HIF-1在细胞内显着激活，转位到细胞核中，与称为HIF-1结合位点的顺式元件结合，并诱导基因表达。因此，我们创建了一个构建体，其中串联连接该 HIF-1 结合位点的增强子序列连接到荧光素酶报告基因的上游。当将此构建体转染至 NIH3T3 细胞并在 1% 缺氧条件下培养时，荧光素酶活性增加约 10 倍，证实此增强子序列对缺氧有反应。接下来，我们创建了一个将该增强子序列连接到HSV-tk基因上游的构建体，并在体外证实了HSV-tk是由缺氧诱导的。然后，我们将这种构建体显微注射到受精的小鼠卵中以产生转基因小鼠。我们计划将来使用已建立的转基因小鼠进行 PET 成像。此外，我们计划建立动脉硬化和心肌梗塞模型，使用PET观察缺血区域，并筛选改善缺血的药物。虽然这项研究在确定响应缺氧的增强子位点和创建转基因小鼠的现有构建体方面进展顺利，但创建转基因小鼠需要时间，因此使用 PET 进行体内研究花了一年时间。我可以观察到信号的点。然而，计划中的实验本身正在按计划进行，预计在不久的将来可以使用 PET 进行观察。

项目成果

Shindo T, et al.: "Renal damage and salt-dependent hypertension in aged transgenic mice overexpressing endothelin-1"J Mol Med.. 80. 105-116 (2002)

Shindo T 等人：“过表达内皮素 1 的老年转基因小鼠的肾损伤和盐依赖性高血压”J Mol Med.. 80. 105-116 (2002)

Takeda N, et al.: "Positron emission tomography predicted recovery of complete A-V nodal dysfunction in a patient with cardiac sarcoidosis"Circulation. 105. 1144-1145 (2002)

Takeda N 等人：“正电子发射断层扫描预测心脏结节病患者房室结功能障碍完全恢复”循环。