「血管壁ナトリウム利尿ペプチド系」の臨床的意義に関する発生学的、分子生物学的研究

“血管壁利钠肽系统”临床意义的胚胎学和分子生物学研究

• 批准号: 07671131
• 负责人: 伊藤 裕
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07671131/
• 关键词: ノックアウトマウス; 遺伝子クローニング; アデノウィルス; 遺伝子導入; 遺伝子治療; 細胞増殖; 血管平滑筋細胞

1)マウスCNP遺伝子クローニングとCNPノックアウトマウスの開発:BALB/cマウス遺伝子ライブラリー10^6クローンをラットCNPcDNAプローブを用いてスクリーニングした。これよりマウスCNP遺伝子を含む2.6kbのDNA断片のクローニングに成功した。マウスCNP遺伝子はともに少なくとも3つのエクソンと2つのイントロンから構成されていることが明らかとなった。マウスCNP遺伝子5′-隣接領域の近位部にはTATA box, cAMP応答因子様配列、SP1結合部(GC box)、逆向きCCAAT配列(Y box)が認められた。また、その上流に25回のCA反復配列(マイクロサテライト)が認められた。我々は既にTGF-β及びTNF-αにより内皮細胞におけるCNP遺伝子発現が著明に亢進することを報告してきたが、マウスCNP遺伝子の5′-隣接領域及び第1イントロンには各々TGF-β応答因子様配列、NF-κB結合部位が存在しその重要性が示唆された。PCR法による組換え近交系マウス間のマイクロサテライト多型の解析により、マウスCNP遺伝子は、Ren-1遺伝子と同じ第1染色体上のAcrgとInの間に存在することが明らかになった。更に、マウスCNP遺伝子の第1エクソンの部分をネオマイシン耐性遺伝子にて破壊し、HSV-TK遺伝子を連結したターゲッティングベクターを作製した。このターゲッティングベクターをマウス胚幹細胞(ES細胞)にエレクトロポレーション法にて導入し、ホジティブ・ネガティブ選択法にて組同組換え体を選択し、生殖キメラマウスの作製に成功した。現在、ホモ接合体(ノックアウトマウス)を開発中である。2)アデノウィルスを用いたCNP遺伝子導入による血管平滑筋細胞増殖抑制の検討及び増殖性血管病変の遺伝子治療への応用:E1部分を除いたヒト5型アデノウィルスゲノムとCMVプロモーター及びヒトCNP cDNAを組み込んだシャトルベクターを293細胞内で相同組換えさせることにより、CNP遺伝子発現アデノウィルスベクター(Ad. CMV/CNP)の作成に成功した。ラット大動脈血管平滑筋細胞に対し、Ad. CMV/CNPを40moi(pfu/cell)となるように感染させた。細胞培養上清中のCNP濃度は、Ad. CMV/CNP感染群では122±44pmol/10^6 cellsであり、これは内皮細胞のCNP産生(32±5fmol/10^6 cells)の約4000倍であった。このAd. CMV/CNP感染群ではほぼ完全な増殖抑制効果が認められた。アデノウィルスベクターにより遺伝子導入されたCNPは血管平滑筋細胞に対してオートクリン、パラクリン因子として増殖抑制効果を発揮し、CNP遺伝子の過剰発現は増殖性血管病変に対する遺伝子治療に有用であることが示唆された。

1）使用大鼠CNPCDNA探针筛选小鼠CNP基因克隆和CNP敲除小鼠的开发：BALB/C小鼠基因库10^6克隆。这成功地克隆了2.6kb DNA片段，包括小鼠CNP基因。小鼠CNP基因均由至少三个exonson和两个固醇组成。小鼠CNP基因5 n-Near相邻区域的相邻区域是TATA盒，CAMP响应因子序列，SP1结合部分（GC框）和反向CCAAT序列（Ybox）。另外，在上游观察到25个CA重复阵列（微卫星）。我们已经报道说，TGF-β和TNF-α在内皮细胞中具有显着增强的CNP基因表达，但是对小鼠CNP基因5'-ADJACACEST的TGF-β反应和第一个内含子。和NF-κB连接站点，表明其重要性。通过PCR方法，重组近壳小鼠之间的微卫星多态性分析表明，ACRG与REN-1基因相同的第一个染色体之间存在小鼠CNP基因。此外，连接HSV-TK基因的靶向载体被小鼠CNP基因的新霉素耐药基因破坏，并连接了HSV-TK基因。将该靶向载体引入到小鼠胚胎干细胞（ES细胞）中的电穿孔方法中，在Hodly负选择方法中选定的分类重组者，并成功地产生了生殖嵌合体小鼠。目前，我们正在开发HOMO托梁（淘汰鼠标）。 2）使用腺病毒检查的CNP基因通过引入CNP基因来抑制血管平滑肌细胞的生长，并应用于增殖性血管病变的遗传处理：掺入人类5英寸腺病毒，CMV启动子和人类CNP CDNA排除CNP基因表达。向量（AD。CMV/CNP）成功地在293个单元格中创建了班车向量。 AD。 CMV/CNP感染组的CNP浓度为122±44 pmol/10^6细胞，约为内皮细胞的CNP产生（32±5fmol/10^6细胞）的4000倍。是。该AD。 CNP是通过腺病毒载体遗传的，具有血管平滑肌细胞的自分泌和帕拉克林因子的繁殖效果，这表明CNP基因过度表达对于增殖血管有用。

项目成果

N. Tamura et al.: "cDNA cloning and gene expression of human type I alpha cGMP-dependent protein kinase." Hypertension. (in press).

N. Tamura 等人：“人 I 型 α cGMP 依赖性蛋白激酶的 cDNA 克隆和基因表达。”

N. Hama et al.: "Rapid ventricular induction of brain natriuretic gene expression in experimental acute myocardial infarction." Circulation. 92. 1558-1564 (1995)

N. Hama 等人：“实验性急性心肌梗塞中脑钠尿基因表达的快速心室诱导”。

Y. Komatsu et al.: "Regulation of secretion and clearance of C-type natriuretic peptide in the interaction of vascular endothelial cells and smooth muscle cells." J. Hypertens.(in press).

Y. Komatsu 等人：“血管内皮细胞和平滑肌细胞相互作用中 C 型利钠肽的分泌和清除的调节。”

S. Sugiyama et al.: "Lipoproteins regulate C-type natriuretic peptide secretion from cultured vascular endothelial cells." Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol.15. 1968-1974 (1995)

S. Sugiyama 等人：“脂蛋白调节培养的血管内皮细胞的 C 型利钠肽分泌。”

J. Yamashita et al.: "Cis elements for transcriptional regulation of the human endothelin-A receptor gene." J. Cardiovasc. Pharmacol.26(Suppl. 3). S26-S28 (1995)

J. Yamashita 等人：“人内皮素 A 受体基因转录调节的顺式元件。”