「血管壁ナトリウム利尿ペプチド系」の臨床的意義に関する発生学的、分子生物学的研究

“血管壁利钠肽系统”临床意义的胚胎学和分子生物学研究

• 批准号: 07671131
• 负责人: 伊藤 裕
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07671131/
• 关键词: ノックアウトマウス; 遺伝子クローニング; アデノウィルス; 遺伝子導入; 遺伝子治療; 細胞増殖; 血管平滑筋細胞

1)マウスCNP遺伝子クローニングとCNPノックアウトマウスの開発:BALB/cマウス遺伝子ライブラリー10^6クローンをラットCNPcDNAプローブを用いてスクリーニングした。これよりマウスCNP遺伝子を含む2.6kbのDNA断片のクローニングに成功した。マウスCNP遺伝子はともに少なくとも3つのエクソンと2つのイントロンから構成されていることが明らかとなった。マウスCNP遺伝子5′-隣接領域の近位部にはTATA box, cAMP応答因子様配列、SP1結合部(GC box)、逆向きCCAAT配列(Y box)が認められた。また、その上流に25回のCA反復配列(マイクロサテライト)が認められた。我々は既にTGF-β及びTNF-αにより内皮細胞におけるCNP遺伝子発現が著明に亢進することを報告してきたが、マウスCNP遺伝子の5′-隣接領域及び第1イントロンには各々TGF-β応答因子様配列、NF-κB結合部位が存在しその重要性が示唆された。PCR法による組換え近交系マウス間のマイクロサテライト多型の解析により、マウスCNP遺伝子は、Ren-1遺伝子と同じ第1染色体上のAcrgとInの間に存在することが明らかになった。更に、マウスCNP遺伝子の第1エクソンの部分をネオマイシン耐性遺伝子にて破壊し、HSV-TK遺伝子を連結したターゲッティングベクターを作製した。このターゲッティングベクターをマウス胚幹細胞(ES細胞)にエレクトロポレーション法にて導入し、ホジティブ・ネガティブ選択法にて組同組換え体を選択し、生殖キメラマウスの作製に成功した。現在、ホモ接合体(ノックアウトマウス)を開発中である。2)アデノウィルスを用いたCNP遺伝子導入による血管平滑筋細胞増殖抑制の検討及び増殖性血管病変の遺伝子治療への応用:E1部分を除いたヒト5型アデノウィルスゲノムとCMVプロモーター及びヒトCNP cDNAを組み込んだシャトルベクターを293細胞内で相同組換えさせることにより、CNP遺伝子発現アデノウィルスベクター(Ad. CMV/CNP)の作成に成功した。ラット大動脈血管平滑筋細胞に対し、Ad. CMV/CNPを40moi(pfu/cell)となるように感染させた。細胞培養上清中のCNP濃度は、Ad. CMV/CNP感染群では122±44pmol/10^6 cellsであり、これは内皮細胞のCNP産生(32±5fmol/10^6 cells)の約4000倍であった。このAd. CMV/CNP感染群ではほぼ完全な増殖抑制効果が認められた。アデノウィルスベクターにより遺伝子導入されたCNPは血管平滑筋細胞に対してオートクリン、パラクリン因子として増殖抑制効果を発揮し、CNP遺伝子の過剰発現は増殖性血管病変に対する遺伝子治療に有用であることが示唆された。

1）使用大鼠CNP cDNA探针筛选CNP敲除小鼠的小鼠CNP基因克隆和CNP敲除小鼠的发育：BALB/C小鼠基因库10^6克隆。这成功克隆了包含小鼠CNP基因的2.6 kb DNA片段。已经揭示了两个小鼠CNP基因至少由三个外显子和两个内含子组成。小鼠CNP基因5'Fanking区域的近端部分是TATA盒，一个cAMP响应因子样序列，SP1结合区域（GC框）和倒置的CCAAT序列（Y框）。此外，在上游观察到25个CA重复（微卫星）。我们已经报道说，TGF-β和TNF-α显着增强了内皮细胞中CNP基因的表达，但是小鼠CNP基因的5'-频偏区和第一膜上具有TGF-β响应因子样序列和NF-κB结合位点，表明其重要性。对PCR重组小鼠之间的微卫星多态性的分析表明，小鼠CNP基因与REN-1基因之间的ACRG和IN之间存在于ACRG和IN之间。此外，小鼠CNP基因的第一个外显子的一部分被新霉素耐药基因破坏，并创建了靶向载体，其中HSV-TK基因被绑扎。通过电穿孔将该靶向载体引入小鼠胚胎干细胞（ES细胞）中，并使用同源性负选择方法选择同源重组剂，并成功地产生了生殖嵌合小鼠。目前，正在开发纯合子（淘汰小鼠）。 2）检查血管平滑肌细胞通过CNP基因转移的抑制，使用腺病毒和在基因治疗中应用于增殖性血管病变：通过将E1除外的人类型腺病毒基因组与E1除外，E1的除外，将Shuttle vector e1除外，将CMV启动者和人类CNP CDNA的cys ccdna contna Inscctna Inscctna Inscretimples Ins In In In In In。用AD感染大鼠主动脉血管平滑肌细胞。 CMV/CNP至40 MOI（PFU/Cell）。 AD中的细胞培养上清液中的CNP浓度为122±44pmol/10^6细胞。 CMV/CNP感染的组，大约是内皮细胞CNP产生的4000倍（32±5fmol/10^6细胞）。该组感染了AD。 CMV/CNP几乎完全抑制了生长。用腺病毒载体转基因的CNP对血管平滑肌细胞的增生抑制作用作为自分泌和旁分泌因子，这表明CNP基因的过表达可用于基因治疗，用于增殖性血管病变。

项目成果

N. Tamura et al.: "cDNA cloning and gene expression of human type I alpha cGMP-dependent protein kinase." Hypertension. (in press).

N. Tamura 等人：“人 I 型 α cGMP 依赖性蛋白激酶的 cDNA 克隆和基因表达。”

N. Hama et al.: "Rapid ventricular induction of brain natriuretic gene expression in experimental acute myocardial infarction." Circulation. 92. 1558-1564 (1995)

N. Hama 等人：“实验性急性心肌梗塞中脑钠尿基因表达的快速心室诱导”。

S. Sugiyama et al.: "Lipoproteins regulate C-type natriuretic peptide secretion from cultured vascular endothelial cells." Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol.15. 1968-1974 (1995)

S. Sugiyama 等人：“脂蛋白调节培养的血管内皮细胞的 C 型利钠肽分泌。”

Y. Komatsu et al.: "Regulation of secretion and clearance of C-type natriuretic peptide in the interaction of vascular endothelial cells and smooth muscle cells." J. Hypertens.(in press).

Y. Komatsu 等人：“血管内皮细胞和平滑肌细胞相互作用中 C 型利钠肽的分泌和清除的调节。”

J. Hiraoka et al.: "Augmented expression of the endothelin-A receptor gene in cultured mesangial cells from stroke-prove spontaneously hypertensive rats." Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. Suppl 1. S191-S192 (1995)

J. Hiraoka 等人：“中风培养的系膜细胞中内皮素 A 受体基因的表达增强，证明是自发性高血压大鼠。”