ピルビン酸キナーゼ異常症モデルマウスにおける遺伝性溶血性貧血の発症機構解明

丙酮酸激酶紊乱模型小鼠遗传性溶血性贫血发病机制的阐明

• 批准号: 07670182
• 负责人: 菅野 仁
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: Okinaka Memorial Institute for Medical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07670182/
• 关键词: 赤血球; 代謝異常; 疾患モデル

CBAマウス純系コロニー内に自然発症した遺伝性溶血性貧血症の原因を明らかにするため、赤血球酵素活性および解糖中間体の測定、赤血球・肝臓抽出液のイムノブロット解析、肝臓抽出液のアイソザイム解析を行った。赤血球酵素活性の検索では溶血性貧血マウスの赤血球PK活性は正常の3%以下に低下し、PKより上位の解糖系中間代謝産物の蓄積を認めたためこの貧血がPK異常症によることが明らかになった。肝(L)型PKに対するポリクローナル抗体を用いたイムノブロット解析では、赤血球・肝臓内のPKサブユニットの量および分子量に変異マウスと正常対照との差は認めなかったが、変異マウス肝臓抽出液の活性染色では本来認められるL型アイソザイム活性は認められず、正常肝ではごく低い発現を認めるM2型PK活性のみが検出された。このことから変異マウス赤血球および肝のPK蛋白量はほとんど正常だが、その活性はほぼ完全に消失していることが明らかになった。RACE法にてCBA系マウス骨髄mRNAからマウス赤血球(R)型PKcDNAクローニングを行い、得られた配列をもとに異常マウスの分子異常を決定した。マウスR型PKcDNAは574アミノ酸をコードし、翻訳領域におけるヒトR型PKとの相同性は塩基レベルで86.1%、アミノ酸レベルで91.5%であった。PK異常マウスのR型PKcDNAの塩基配列を解析したところ、単一塩基置換1013GGT→GATのホモ接合体であることが明らかになった。この変異によりR型PKの活性中心を構成する338番目のGlyがAspに置換する。337番目のArg残基を中心にした5つのアミノ酸はPK遺伝子のエクソン8にコードされ、基質ホスホエノールプルビン酸との結合に重要であり、この変異により活性中心の構造変化が引き起こされ、基質親和性が低下して赤血球内の生理的基質濃度におけるPK活性がほとんど消失したものと結論できた。ヒトPK異常症においても同様の活性中心変異が同定されており、その赤血球PKの解析で本来成熟赤血球には残存しないM2型PKが検出されている。同様の重篤な構造変異でありながら本マウスのPK異常症がヒトのPK異常症より貧血の重症度が軽いのは、主として脾臓において対照の約66倍もの著明な赤芽球産生の亢進が存在することによると考えられる。このPK異常症マウスはヒトPK異常症の病態解析および新しい治療法開発に極めて有用と考えられる。

为了阐明CBA小鼠纯种群体自发发生的遗传性溶血性贫血的原因，对红细胞酶活性和糖酵解中间体进行了测定，对红细胞和肝脏提取物进行了免疫印迹分析，并对肝脏提取物进行了同工酶分析。做到了。在寻找红细胞酶活性时，溶血性贫血小鼠的红细胞PK活性下降至正常值的3%以下，并且发现高于PK的糖酵解中间代谢产物的积累，明确这种贫血是由红细胞酶活性引起的。由于PK失调。使用针对肝（L）型PK的多克隆抗体进行的免疫印迹分析显示，突变小鼠和正常对照之间红细胞和肝脏中PK亚基的数量或分子量没有差异；在活性染色中，最初观察到的L型同工酶活性未观察到，仅检测到M2型PK活性，其在正常肝脏中以非常低的水平表达。这些结果表明，虽然突变小鼠红细胞和肝脏中PK蛋白的量几乎正常，但其活性几乎完全消失。采用RACE法从CBA小鼠骨髓mRNA中克隆小鼠红细胞（R）型PK cDNA，并根据获得的序列判断异常小鼠的分子异常。小鼠R型PK cDNA编码574个氨基酸，翻译区与人R型PK的同源性在碱基水平上为86.1％，在氨基酸水平上为91.5％。对PK异常小鼠的R型PK cDNA的碱基序列分析表明，其单碱基取代1013GGT→GAT是纯合的。该突变将构成R型PK活性中心的338位Gly替换为Asp。以第337号Arg残基为中心的5个氨基酸编码在PK基因的外显子8中，对于与底物磷酸烯醇嘌呤的结合非常重要，并且该突变引起活性中心的结构变化，从而导致与底物的结合。亲和力降低，红细胞内生理底物浓度下的 PK 活性几乎消失。在人类 PK 疾病中也发现了类似的活性中心突变，并且红细胞 PK 分析检测到了 M2 型 PK，这种突变通常不会保留在成熟红细胞中。虽然该小鼠的 PK 异常具有类似的严重结构突变，但该小鼠 PK 异常的贫血严重程度低于人类 PK 异常，主要是由于脾脏中成红细胞的产生显着增加，约为人类 PK 异常的 66 倍。这被认为是由于控制的存在。这些 PK 异常小鼠被认为对于人类 PK 异常的病理分析和新疗法的开发极其有用。

项目成果

M. Morimoto, H. Kanno et al.: "Pyruvate kinase deficiency of mice associated with nonspherocytic hemolytic anemia and cure of the anemia by marrow transplantation without host irradiation" BLOOD. 86. 4323-4330 (1995)

M. Morimoto、H. Kanno 等人：“与非球形细胞溶血性贫血相关的小鼠丙酮酸激酶缺乏症以及通过骨髓移植无需宿主辐射来治愈贫血”BLOOD。

Hitoshi Kanno, et al.: "Primary structure of murine red blood cell-type pyruvate kinase(PK)and molecular characterization of PK deficiency identified in the CBA strain" BLOOD. 86. 3205-3210 (1995)

Hitoshi Kanno 等人：“鼠红细胞型丙酮酸激酶 (PK) 的一级结构和 CBA 菌株中鉴定的 PK 缺陷的分子特征”BLOOD。