ヒトH^+-ATP合成酵素subunit b遺伝子の発現制御に係る蛋白質因子の解析

人H^+-ATP合酶b亚基基因表达调控蛋白因子分析

基本信息

批准号：
05680555
负责人：
樋口富彦
金额：
$ 1.34万
依托单位：
The University of Tokushima
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

subunit b遺伝子の構造は,部分的にしか決定していなかったが,今年度,再度subunit bの遺伝子を含んでいるクローンを単離し,全構造を決定した.その結果,ヒトsubunit bは,8つのExonにわかれてコードされていることが明らかとなった.ついで,昨年度明らかになっていたlstイントロン内エンハンサーについて,コンピューターによるホモロジーサーチを行ったところ,この27bps断片中には,Spl結合配列が1つ存在していた.そこで,次にこのSpl binding siteが本当に転写の増強に関与しているかを調べるために,塩基置換を行いmRNAの量をRPA法で測定した.その結果,Splの特にコアになる部分のmutantでは元の活性の3分の1の活性となり,その後半部分を変異させたものは約65%の活性,Spl結合部位を欠損させたもので約60%の活性が残っていた.従って,subunit bのlstイントロン内エンハンサーは,Splだけでなく,+160〜+170の塩基配列が関係していると結論された.次に,この部分の塩基配列に特異的に結合する核蛋白質の解析をゲル移動度シフト法により行った.プローブDNAとしては、subunit b遺伝子のlstエクソンとlstイントロンを含む172bpの断片をPCR法で合成し用いた.このラベルしたプローブDNAをHeLa cell 3SCから調製した核抽出蛋白質と反応させたところ,4本のバンドが観察された.つぎに結合の特異性を調べるため,プローブDNAと核抽出蛋白質と反応後,35bp断片(+149から+183)の非標識の二本鎖合成オリゴヌクレオチドを競合DNAとして加えたところ,これらの4本のバンドは消失した.従って,これら4本のバンドは,35bpの配列に核抽出液中の蛋白質が特異的かつ可逆的に結合したものと考えられ,これらの核蛋白質が,エンハンサーとして働いていることが強く示唆され,現在,non-binding mutations実験とそれらの蛋白質の単離精製を行っている.

亚基B基因的结构仅部分确定，但是今年，含有亚基B基因的克隆再次被遗传，因此确定了整个结构。分为外显子，并同时与LST内含子的计算机进行了同源性搜索，该搜索是去年揭示的，为了找出这种SPL结合位点是否真正涉及转移的增强，将其通过RPA方法来测量。最初的活动，后半部分约为活动的65％，SPL加入的位点，约60％的活动仍然存在。 +160至+170和SPL的基础序列是通过凝胶迁移率的分析作为探针DNA进行的。并使用了从细胞3SC制备的核提取物蛋白后使用的。 +149。强烈建议这些核蛋白正在作为增强剂起作用，目前正在进行其蛋白质的非结合和隔离。