タンパク質ドメインを固定化した充填剤による光学分割

使用具有固定蛋白结构域的包装材料进行光学分辨率

• 批准号: 05671799
• 负责人: 萩中 淳
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Mukogawa Women's University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-05671799/
• 关键词: オボムコイド; オボムコイドドメイン; 光学分割; キラル充填剤; 計算化学

本年度は以下の検討を行った。1)七面鳥オボムコイド(OMTKY)よりドメインを単離精製する、2)単離したドメインを固定化し、光学認識能を精査する、3)糖鎖含有ドメインと糖鎖フリードメインの光学認識能の比較より光学認識における糖鎖の役割を検討する、4)NMRを用いて光学認識サイトを明らかにする、5)分子モデルを用いるコンピューターシミュレーションによる結合サイトの検討を行う。七面鳥の卵白より常法に従ってOMTKYを単離した。次に、Staphlococcus aureus Strain V8を用いて、単離したOMTKYのドメイン間のコネクションペプチドを切断した。その結果、セカンドドメイン(OMTKY2)、糖鎖フリーサードドメインおよび糖鎖含有サードドメイン(OMTKY3およびOMTKY3S)を単離することができた。得れた各ドメインをN,N′‐disuccinimidyl carbonateで活性化したaminopropyl‐silicagelに固定化し、内径4.6mmおよび2.0mm、長さ100mmのステンレスカラムに充填し、光学分割能を検討した。OMTKY3を固定化したカラムは、ベンゾジアゼピン系化合物(lorazepam、clorazepate)および2‐アリルプロピオン酸誘導体(pranoprofen、U‐80,413)に対して光学認識能を示した。これらの化合物はOMTKY3およびOMTKY3Sカラム上でほぼ同等の保持を与えた。一方、エナンチオ選択性はOMTKY3カラムのほうがわずかに優れていた。サードドメインでのこれらの化合物の光学認識に糖鎖は関与していないことを示唆している。一方、OMTKY2カラムは、検討した化合物に対して認識能を示さなかった。OMTKY3におけるこれらの化合物の光学認識サイトを明らかにするため、ニワトリオボムコイドサードドメイン(OMCHI3)でのこれら化合物の滴定およびOMCHI3との複合体のNuclear Overhauser Enhancement Spectroscopy(NOESY)データを得た。その結果、これらの化合物はVa16、Phe53、Leu23およびLys34と相互作用をしているのではないかということが示唆された。また、U‐80,413エナンチオマーの結合定数は、2.5×10^3および1.7×10^3であると算出された。OMTKY3とOMCHI3のアミノ酸配列は、3残基が異なっているだけで、上記の推定結合サイトのアミノ酸配列は同等であることから、OMTKY3においても同様の相互作用をしているものと推定した。分子モデルを用いるコンピューターシミュレーションによる結合サイトは、上記結果を支持した。

今年，我们进行了以下研究。 1) 从火鸡卵类粘蛋白 (OMTKY) 中分离和纯化该结构域，2) 固定分离的结构域并检查其光学识别能力，以及 3) 比较含碳水化合物结构域和不含碳水化合物结构域的光学识别能力。检查糖链在光学识别中的作用，4) 使用 NMR 揭示光学识别位点，5) 使用分子模型通过计算机模拟检查结合位点。 OMTKY是按照常规方法从火鸡蛋清中分离得到的。接下来，使用金黄色葡萄球菌菌株 V8 切割分离的 OMTKY 结构域之间的连接肽。结果，我们能够分离出第二个结构域（OMTKY2）、不含糖链的第三个结构域和含有糖链的第三个结构域（OMTKY3和OMTKY3S）。将获得的每个结构域固定在用N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯活化的氨丙基硅胶上，填充到内径为4.6mm和2.0mm、长度为100mm的不锈钢柱中，并检查光学分辨率。固定有 OMTKY3 的柱表现出对苯二氮卓类化合物（劳拉西泮、氯拉西泮）和 2-烯丙基丙酸衍生物（普拉洛芬、U-80,413）的光学识别能力。这些化合物在 OMTKY3 和 OMTKY3S 色谱柱上的保留量大致相同。另一方面，OMTKY3 色谱柱的对映选择性稍好一些。这表明糖链不参与第三结构域中这些化合物的光学识别。另一方面，OMTKY2 色谱柱对测试化合物没有表现出识别能力。为了阐明这些化合物在 OMTKY3 中的光学识别位点，我们获得了这些化合物在鸡卵类粘蛋白第三结构域 (OMCHI3) 中的滴定以及它们与 OMCHI3 复合物的核奥沃豪瑟增强光谱 (NOESY) 数据。结果表明这些化合物可能与 Va16、Phe53、Leu23 和 Lys34 相互作用。此外，U-80,413 对映体的结合常数计算为 2.5×10^3 和 1.7×10^3。由于OMTKY3和OMCHI3的氨基酸序列仅在三个残基上不同，并且上述推定的结合位点的氨基酸序列相同，因此推测OMTKY3具有相似的相互作用。使用分子模型对结合位点进行计算机模拟支持了上述结果。