タンパク質ドメインを固定化した充填剤による光学分割

使用具有固定蛋白结构域的包装材料进行光学分辨率

• 批准号: 05671799
• 负责人: 萩中 淳
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Mukogawa Women's University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-05671799/
• 关键词: オボムコイド; オボムコイドドメイン; 光学分割; キラル充填剤; 計算化学

本年度は以下の検討を行った。1)七面鳥オボムコイド(OMTKY)よりドメインを単離精製する、2)単離したドメインを固定化し、光学認識能を精査する、3)糖鎖含有ドメインと糖鎖フリードメインの光学認識能の比較より光学認識における糖鎖の役割を検討する、4)NMRを用いて光学認識サイトを明らかにする、5)分子モデルを用いるコンピューターシミュレーションによる結合サイトの検討を行う。七面鳥の卵白より常法に従ってOMTKYを単離した。次に、Staphlococcus aureus Strain V8を用いて、単離したOMTKYのドメイン間のコネクションペプチドを切断した。その結果、セカンドドメイン(OMTKY2)、糖鎖フリーサードドメインおよび糖鎖含有サードドメイン(OMTKY3およびOMTKY3S)を単離することができた。得れた各ドメインをN,N′‐disuccinimidyl carbonateで活性化したaminopropyl‐silicagelに固定化し、内径4.6mmおよび2.0mm、長さ100mmのステンレスカラムに充填し、光学分割能を検討した。OMTKY3を固定化したカラムは、ベンゾジアゼピン系化合物(lorazepam、clorazepate)および2‐アリルプロピオン酸誘導体(pranoprofen、U‐80,413)に対して光学認識能を示した。これらの化合物はOMTKY3およびOMTKY3Sカラム上でほぼ同等の保持を与えた。一方、エナンチオ選択性はOMTKY3カラムのほうがわずかに優れていた。サードドメインでのこれらの化合物の光学認識に糖鎖は関与していないことを示唆している。一方、OMTKY2カラムは、検討した化合物に対して認識能を示さなかった。OMTKY3におけるこれらの化合物の光学認識サイトを明らかにするため、ニワトリオボムコイドサードドメイン(OMCHI3)でのこれら化合物の滴定およびOMCHI3との複合体のNuclear Overhauser Enhancement Spectroscopy(NOESY)データを得た。その結果、これらの化合物はVa16、Phe53、Leu23およびLys34と相互作用をしているのではないかということが示唆された。また、U‐80,413エナンチオマーの結合定数は、2.5×10^3および1.7×10^3であると算出された。OMTKY3とOMCHI3のアミノ酸配列は、3残基が異なっているだけで、上記の推定結合サイトのアミノ酸配列は同等であることから、OMTKY3においても同様の相互作用をしているものと推定した。分子モデルを用いるコンピューターシミュレーションによる結合サイトは、上記結果を支持した。

今年，我们进行了以下考虑：1）来自土耳其卵球形的分离和纯化结构域（柔软），2）固定孤立的域并检查其光学识别能力，3）考虑到聚糖在光学识别中的作用，通过比较含糖链的光学识别和糖链的光学识别能力，并使用nmriage nmr criel nmr crian ins clindical nmr ins cripition，使用分子模型通过计算机模拟站点。根据常规方法，将其从土耳其蛋清中分离出来。接下来，使用金黄色葡萄球菌V8来裂解分离的粘液域之间的连接肽。结果，第二个域（OMTKY2），无聚糖的第三域和含聚糖的第三域（OMTKY3和OMTKY3S）可以隔离。将每个获得的结构域固定在用N，N'-二糖酰亚胺酸酯激活的氨基丙基 - 硅胶上，并将内径为4.6 mm和2.0 mm，长度为100 mm，并研究了光学分辨率的能力。固定omtky3的柱显示了苯二氮卓类化合物（Lorazepam，氯氮蛋白酶）和2-甲基丙二酸衍生物（Pranoprofen，U-80,413）的光学识别能力。这些化合物在OMTKY3和OMTKY3S列上提供了大致相等的保留率。另一方面，OMTKY3色谱柱上的对映选择性稍好一些。这表明糖不参与第三个域中这些化合物的光学识别。另一方面，OMTKY2列对所研究化合物没有识别能力。为了阐明OMTKY3中这些化合物的光学识别位点，我们在炸鸡炸弹式第三域（OMCHI3）和核大旋转器增强光谱（NOESY）数据中获得了这些化合物的滴定。结果表明，这些化合物可能与VA16，PHE53，LEU23和LYS34相互作用。 U-80,413对映异构体的结合常数也被计算为2.5×10^3和1.7×10^3。由于OMTKY3和OMCHI3的氨基酸序列仅在三个残基中有所不同，并且上述假定结合位点的氨基酸序列等效，因此估计OMTKY3也具有相似的相互作用。通过计算机模拟使用分子模型的结合位点支持上述结果。