呼吸不全動物肺および培養肺胞上皮細胞による肺病変修復過程の分子生物学的検索

利用呼吸衰竭动物肺和培养肺泡上皮细胞对肺部病变修复过程进行分子生物学研究

基本信息

批准号：
04807112
负责人：
須加原一博
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Kumamoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1992
资助国家：
日本
起止时间：
1992 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

I.培養肺胞II型上皮細胞の増殖・分化と肺特異蛋白遺伝子の発現動態:II型細胞をラット肺より分離しEngelbreth-Holm-Swarm(EHS)上に培養し、インスリンやEGFなどの成長因子で刺激すると細胞のDNA合成が数十倍に増加し肉眼的にも確認できるほどの細胞塊を形成した。抗SP-A抗体でも強く染色されSP-A産生能を持つII型細胞増殖が確認された。細胞増殖に伴う肺表面活性物質アポ蛋白遺伝子の発現動態をノーザン・ブロット法により検索すると、SP-A mRNAとSP-C mRNAの減少およびSP-B mRNAの軽度増加がみられ、興味深いことにこの変化はin vitroで可逆的であった。現在、II型細胞の増殖を惹起するリポポリサッカライド(LPS)による呼吸不全動物を作製し、抗SP-A抗体によるII型細胞増殖を確認し肺表面活性物質アポ蛋白遺伝子発現動態を検索している。II.ストレプトゾトシン誘発糖尿病ラット肺における肺表面活性物質アポ蛋白SP-A,SP-BおよびSP-Cの遺伝子発現:糖尿病ラット肺では2型細胞と気道のクララ細胞が特異的に障害されサーファクタントの合成障害が起こる。SP-A蛋白の免疫染色での染色性低下、ELISA法によるSP-A蛋白測定での低下に反し、in situ hybridization法によるSP-A mRNAの発現検索では、予想に反して過剰発現していた。この過剰発現はノーザン・ブロット法による分析でも確認され、アポ蛋白遺伝子調節にフィードバック機構の存在が示唆された。SP-B mRNAもSP-Aと同様に過剰発現がみられたが、特にクララ細胞に強く発現していた。SP-C mRNAでは逆にコントロール群に比し発現の低下が観察され、気道粘膜上皮細胞には両群ともに発現がみられなかった。3つのアポ蛋白に遺伝子発現の差がみられ、糖尿病病態が3つのアポ蛋白遺伝子発現に関し何らかの制御異常を示しているものと思われた。III.培養肺胞II型上皮細胞によるDNA修復研究:DNA損傷は癌の発生と密接な関係があると考えられているが、紫外線による肺胞上皮細胞のDNA切断をin situ nick translation法により検討しDNA損傷の修復が確認された。

一、培养肺泡II型上皮细胞的增殖分化及肺特异性蛋白基因表达动态：从大鼠肺中分离II型细胞，在Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）上培养，胰岛素、EGF等生长当受到该因子刺激时，细胞DNA合成增加数十倍，形成肉眼可见的细胞簇。它还被抗 SP-A 抗体强烈染色，证实了能够产生 SP-A 的 II 型细胞的增殖。有趣的是，当我们使用Northern blotting寻找肺表面活性剂脱辅基蛋白基因随细胞增殖的表达动态时，我们观察到SP-A mRNA和SP-C mRNA的减少以及SP-B mRNA的轻微增加，这些变化是可逆的。体外。目前，我们正在使用诱导II型细胞增殖的脂多糖（LPS）产生呼吸功能不全的动物，使用抗SP-A抗体确认II型细胞增殖，并研究肺表面活性剂脱辅基蛋白基因表达的动态。 II.链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠肺中肺表面活性剂脱辅基蛋白SP-A、SP-B和SP-C的基因表达：糖尿病大鼠肺中2型细胞和气道Clara细胞合成表面活性剂发生特异性受损。与免疫染色中 SP-A 蛋白染色的减少和 ELISA 测量中 SP-A 蛋白测量的减少相反，通过原位杂交的 SP-A mRNA 表达搜索显示其过度表达，与预期相反。 Northern印迹分析也证实了这种过度表达，表明脱辅基蛋白基因调控中存在反馈机制。 SP-B mRNA 也像 SP-A 一样过表达，但在 Clara 细胞中表达尤其强烈。相反，与对照组相比，SP-C mRNA 表达降低，两组气道粘膜上皮细胞均未观察到表达。观察到三种脱辅基蛋白的基因表达差异，表明糖尿病状况表明三种脱辅基蛋白基因表达存在某种异常调节。 III.利用培养的肺泡II型上皮细胞进行DNA修复研究：DNA损伤被认为与癌症的发生密切相关，我们利用原位切口平移法研究了紫外线对肺泡上皮细胞中DNA切割的修复。 DNA损伤得到证实。