間葉系幹細胞の一過性notch発現制御による神経細胞分化誘導の研究

间充质干细胞Notch表达瞬时调节诱导神经元分化的研究

• 批准号: 19659056
• 负责人: 永富 良一
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2007
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2007 至 2008
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19659056/
• 关键词: 神経細胞; 間葉系幹細胞; Notch; パッチクランプ; Naチャネル; Caチャネル; NMDA受容体; パルス電気刺激; siRNA; MAP2; Tuj1; 電気刺激

多能性分化能を有する間葉系幹細胞のNotch発現をsiRNAで抑制することにより神経細胞様の形態を持ち、神経細胞特異的マーカーが陽性な細胞に分化誘導できることを確認した。しかしパッチクランプ法を用いて細胞膜電位の測定および活動電位の誘導を講みたが活動電位は誘導できなかった。電位非依存性Naチャネルの発現はNatch抑制により強く誘導されたが、電位依存性チャネルの誘導は得られなかった。ピストン脱メチル化酵素あるいはDNAメチル化酵素の阻害はそれぞれ電位依存性NaチャネルmRNAの発現につながったが、Natch抑制を行うと発現が減弱した。そこで間葉系幹細胞にパルス電気刺激を行った結果、Natch抑制条件下においてもヒストン脱メチル化酵素、DNAメチル化酵素阻害による電位依存性Naチャネルの一部の発現が維持されることがわかった。しかし活動電位を得ることには至っていない。mRNAの発現は得られても活動電位を得るのに十分なタンパク発現が得られていない可能性が考えられた。Ca流入を制御する神経組織に特異的な受容体としてNMDA受容体があげられるが、興味深いことに間葉系幹細胞にパルス電気刺激を行うだけでNMDA受容体mRNAの発現が誘導されること、さらにNMDA刺激を行うことにより細胞内Ca濃度が上昇することがわかった(Okutsu, S et al Tohoku J Exp Med. 2008)。したがって間葉系幹細胞の機能的な神経細胞への分化誘導は一過性のNatch抑制に加えてepigeneticな制御および興奮性刺激を行うことにより未だ不完全ではあるが、実現できる可能性があることが明らかになった。上述した進行状況の中でin vivoの脊髄損傷マウスにおける再生実験に取りかかることはできなかった。現在機能的な電位依存性チャネルを誘導する条件を検討中である。

我们证实，通过使用 siRNA 抑制具有多能分化能力的间充质干细胞中的 Notch 表达，可以诱导分化为具有神经元样形态且神经元特异性标记物呈阳性的细胞。然而，尽管我们尝试使用膜片钳方法测量细胞膜电位并诱导动作电位，但我们无法诱导动作电位。 Natch 抑制强烈诱导电压非依赖性 Na 通道的表达，但未获得电压门控通道的诱导。活塞去甲基酶或DNA甲基转移酶的抑制均导致电压门控Na通道mRNA的表达，但Natch抑制减弱了表达。因此，对间充质干细胞施加脉冲电刺激的结果发现，由于组蛋白去甲基化酶和DNA甲基转移酶的抑制，即使在Natch抑制条件下，电压门控Na通道的部分表达也得以维持。然而，目前还不可能获得动作电位。认为即使获得了mRNA表达，也没有获得足以获得动作电位的蛋白质表达。 NMDA 受体被列为控制 Ca2+ 流入的神经组织特异性受体，有趣的是，仅对间充质干细胞施加脉冲电刺激即可诱导 NMDA 受体 mRNA 的表达，结果发现 NMDA 刺激会增加细胞内 Ca2+ 浓度。 (Okutsu, S et al Tohoku J Exp Med. 2008)。因此，虽然还不完全，但除了短暂的Natch抑制之外，还可以通过进行表观遗传控制和兴奋性刺激来诱导间充质干细胞分化为功能性神经元。鉴于上述进展，我们无法在脊髓损伤小鼠中进行体内再生实验。我们目前正在研究诱导功能性电压门控通道的条件。

项目成果

Electric pulse stimulation induces Ca2+ influx into NIH3T3 fibroblasts through L-type calcium channel and promotes expression of NMDA receptor mRNA

电脉冲刺激诱导Ca2通过L型钙通道流入NIH3T3成纤维细胞并促进NMDA受体mRNA表达

• 发表时间: 2008
• 期刊: Tohoku Journal of Experimental Medicine 215(In press)
• 作者: Saeko Okutsu;Hiroyasu Hatake yama;Makoto Kanzaki;Hiroshi Tubokawa;Ryoichi Nagatomi
• 通讯作者: Ryoichi Nagatomi

Electric pulse stimulation induces NMDA glutamate receptor mRNA in NIH3T3 mouse fibroblasts

• DOI: 10.1620/tjem.215.181
• 发表时间: 2008-06-01
• 期刊: TOHOKU JOURNAL OF EXPERIMENTAL MEDICINE
• 影响因子: 2.2
• 作者: Okutsu, Saeko;Hatakeyama, Hiroyasu;Nagatomi, Ryoichi
• 通讯作者: Nagatomi, Ryoichi