遺伝子工学を用いた脳内摂食調節ニューロンネットワーク解析法の開発

开发利用基因工程分析大脑中进食调节神经元网络的方法

基本信息

批准号：
19659047
负责人：
塩田清二
金额：
$ 1.98万
依托单位：
Showa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

项目摘要

本年度はGALP遺伝子転写調節領域の下流にCreリコンビナーゼとタモキシフェン受容体融合タンパク質cDNAを導入したDNAコンストラクトを用いたトランスジェニックマウスの作出を行った。トレーサーとなる蛍光タンパク質を細胞中に高発現させるためにCre-loxPシステムを用いた。これは蛍光タンパク質の発現が目的となる遺伝子のプロモーター活性に依存することなく、強力なプロモーター活性をもつCAGプロモーターによって転写調節をうけるので、トレーサーの発現量は顕著に増大した。GALP mRNA発現は、生後14日目以降に発現することが言われているが、発生期あるいは胎生期に発現するかどうかは不明である。成体におけるニューロンネットワークを可視化することを目的とするので、発生期や胎生期にはトレーサーとなる蛍光タンパク質の発現を抑制しておかなければならない。そこでタモキシフェン(エストロゲン誘導体)特異的に結合するエストロゲン変異受容体とCreリコンビナーゼとの融合タンパク質にすることで、タモキシフェンが結合するまではCreリコンビナーゼは活性化しないというメリットがあるので、時間的にCreリコンビナーゼの活性化を調節した。GALP遺伝子の転写調節領域がどこにあるのか不明なため、GALP遺伝子が導入されているBAC(バクテリア人工染色体)クローンを用いた。Cre-タモキシフェン受容体cDNAを、そのBACクローンに導入した。BACクローン内で相同組換えを起こさせ、組み換わった8ACを調製し、これを受精卵へのインジェクション用のサンプルとした。肥満研究で主に使われている系統であるC57BL/6Jの受精卵へDNAを注入してトランスジェニックマウスの作出に成功した。さらにこのマウスを用いてCreリコンビナーゼが認識するloxP配列導入トランスジェニックマウスの作出にも成功した。

今年，我们使用 DNA 构建体产生了转基因小鼠，其中 Cre 重组酶和他莫昔芬受体融合蛋白 cDNA 被引入 GALP 基因转录调控区的下游。 Cre-loxP 系统用于在细胞中高度表达荧光蛋白作为示踪剂。这是因为荧光蛋白的表达并不依赖于目的基因的启动子活性，而是受到启动子活性较强的CAG启动子的转录调控，因此示踪剂表达量显着增加。据说GALP mRNA表达发生在出生后第14天之后，但尚不清楚它是发生在发育期间还是胚胎期。由于目的是可视化成人的神经元网络，因此在发育和胚胎阶段必须抑制用作示踪剂的荧光蛋白的表达。因此，通过创建Cre重组酶和特异性结合他莫昔芬（雌激素衍生物）的雌激素突变型受体的融合蛋白，优点是Cre重组酶在他莫昔芬结合之前不会被激活，因此Cre重组酶调节了Cre重组酶的激活。由于GALP基因的转录调控区位于何处尚不清楚，因此使用导入了GALP基因的BAC(细菌人工染色体)克隆。将克雷-他莫昔芬受体 cDNA 引入 BAC 克隆中。在BAC克隆内进行同源重组，制备重组8AC，将其用作注射到受精卵中的样品。他们通过将 DNA 注射到 C57BL/6J（一种主要用于肥胖研究的菌株）的受精卵中，成功培育出转基因小鼠。此外，使用该小鼠，我们成功地创建了转基因小鼠，引入了Cre重组酶识别的loxP序列。