遺伝子工学を用いた脳内摂食調節ニューロンネットワーク解析法の開発

开发利用基因工程分析大脑中进食调节神经元网络的方法

基本信息

批准号：
19659047
负责人：
塩田清二
金额：
$ 1.98万
依托单位：
Showa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

项目摘要

本年度はGALP遺伝子転写調節領域の下流にCreリコンビナーゼとタモキシフェン受容体融合タンパク質cDNAを導入したDNAコンストラクトを用いたトランスジェニックマウスの作出を行った。トレーサーとなる蛍光タンパク質を細胞中に高発現させるためにCre-loxPシステムを用いた。これは蛍光タンパク質の発現が目的となる遺伝子のプロモーター活性に依存することなく、強力なプロモーター活性をもつCAGプロモーターによって転写調節をうけるので、トレーサーの発現量は顕著に増大した。GALP mRNA発現は、生後14日目以降に発現することが言われているが、発生期あるいは胎生期に発現するかどうかは不明である。成体におけるニューロンネットワークを可視化することを目的とするので、発生期や胎生期にはトレーサーとなる蛍光タンパク質の発現を抑制しておかなければならない。そこでタモキシフェン(エストロゲン誘導体)特異的に結合するエストロゲン変異受容体とCreリコンビナーゼとの融合タンパク質にすることで、タモキシフェンが結合するまではCreリコンビナーゼは活性化しないというメリットがあるので、時間的にCreリコンビナーゼの活性化を調節した。GALP遺伝子の転写調節領域がどこにあるのか不明なため、GALP遺伝子が導入されているBAC(バクテリア人工染色体)クローンを用いた。Cre-タモキシフェン受容体cDNAを、そのBACクローンに導入した。BACクローン内で相同組換えを起こさせ、組み換わった8ACを調製し、これを受精卵へのインジェクション用のサンプルとした。肥満研究で主に使われている系統であるC57BL/6Jの受精卵へDNAを注入してトランスジェニックマウスの作出に成功した。さらにこのマウスを用いてCreリコンビナーゼが認識するloxP配列導入トランスジェニックマウスの作出にも成功した。

今年，我们使用DNA构建体创建了转基因小鼠，其中CRE重组酶和他莫昔芬受体融合蛋白cDNA被引入了GALP基因转录调节区域的下游。 Cre-loxp系统用于增强将成为细胞中示踪剂的荧光蛋白的表达。这不取决于该基因在荧光蛋白表达的启动子活性，而是由具有强启动子活性的CAG启动子进行转录调节，因此示踪剂的表达水平显着增加。据说GALP mRNA表达在生命的14天后表达，但尚不清楚它是在新生还是胎儿阶段表达的。目的是可视化成年人的神经元网络，因此必须在新生和胎儿阶段抑制变为示踪剂的荧光蛋白的表达。因此，通过使其成为雌激素突变受体之间的融合蛋白，该雌激素突变受体特异性结合了他莫昔芬（雌激素衍生物）和CRE重组酶，CRE重组酶具有一个优势，即直到他莫昔芬结合，CRE重物组合酶才能被激活，因此CRE再组织酶的激活被调节了过度的过时。由于未知GALP基因的转录调节区域所在的位置，因此使用了GALP基因的BAC（细菌人造染色体）克隆。将Cre-Tamoxifen受体cDNA引入BAC克隆中。在BAC克隆中进行了同源重组，以制备重组8AC，该重组被用作注入受精卵的样品。通过将DNA注射到C57BL/6J的受精卵中，成功产生转基因小鼠，该菌株主要用于肥胖研究。此外，我们成功地创建了转基因的转基因小鼠，该小鼠被CRE重组酶转导的转基因，这些小鼠由LOXP序列识别。