ダイズタンパク質の生産を調節する小胞体品質管理機構に関する研究

调控大豆蛋白生产的内质网质量控制机制研究

基本信息

批准号：
18658055
负责人：
裏出令子
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

项目摘要

平成19年度はダイズ種子貯蔵タンパク質の高次構造形成に関わる小胞体タンパク質を同定し、それらの構造・機能解析及び発現パターン解析を行った。まず、アレイ解析による小胞体タンパク質品質管理関連タンパク質を探索した。その結果、約480種の遺伝子を選別した。これにより得られた情報を植物の遺伝子データベース(TIGRダイズESTクローン情報、TAIR Arabidopsis thalianaゲノム情報等)上でFASTAホモロジー検索によりパラログ遺伝子を探査し、高次構造形成に関わるタンパク質12種類を同定した。TIGRダイズESTクローン情報を元にデザインしたプライマーを用いて、13種類の遺伝子のcDNAをクローニングし一次構造を明らかにした。さらに、6種類の遺伝子についてゲノム遺伝子をクローニングし、エキソン・イントロン構成を明らかにした。クローニングしたcDNAを用いてリコンビナントタンパク質の大腸菌での大量発現、純化、抗体作製を行った。ダイズ種子登熟過程におけるmRNA及びタンパク質の発現推移を明らかにした。これらのうち、プロテインジスルフィドイソメラーゼファミリータンパク質7種について、酵素活性及び分子シャペロン活性を測定し、5種類に酵素活性を6種類に分子シャペロン活性を検出した。さらに、未熟大豆種子を用いて免疫沈降実験を行い4種類のプロテインジスルフィドイソメラーゼファミリーがグリシニンの前駆体と小胞体で会合していることを証明した。また、3種類はβコングリシニンとも会合し、これら主要種子貯蔵タンパク質の高次構造形成への関与を世界に先駆けて証明した。

2007年，我们鉴定了参与大豆种子储存蛋白高级结构形成的内质网蛋白，并分析了它们的结构、功能和表达模式。首先，我们使用阵列分析寻找与内质网蛋白质量控制相关的蛋白质。结果，选择了大约480个基因。利用由此获得的信息，我们通过植物基因数据库（TIGR大豆EST克隆信息、TAIR拟南芥基因组信息等）的FASTA同源搜索来搜索旁系同源基因，并鉴定了参与高级结构形成的12种蛋白质。利用根据TIGR大豆EST克隆信息设计的引物，我们克隆了13个基因的cDNA并阐明了它们的一级结构。此外，还克隆了六类基因的基因组基因，并阐明了外显子/内含子结构。使用克隆的 cDNA，我们在大肠杆菌中进行了重组蛋白的大量表达、纯化和抗体生产。我们阐明了大豆种子成熟过程中mRNA和蛋白质的表达变化。其中，测定了7种蛋白质二硫键异构酶家族蛋白的酶活性和分子伴侣活性，检测了5种和6种的酶活性和分子伴侣活性。此外，我们使用未成熟的大豆种子进行了免疫沉淀实验，并证明了四种蛋白质二硫键异构酶家族与内质网中的大豆球蛋白前体相关。这三种类型也与 β-伴大豆球蛋白相关，我们是世界上第一个证明它们参与这些主要种子储存蛋白的高级结构的形成的人。