遺伝子機能阻害を基礎としたアミノ酸の情報伝達機構の解析

基于基因功能抑制的氨基酸信息传递机制分析

基本信息

批准号：
18658053
负责人：
加藤久典
金额：
$ 2.18万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

项目摘要

昨年度の研究において、転写因子ATF-4およびボスファターゼPP1cのノックダウンがアミノ酸情報伝達を減弱させることを見いだした。本年度はこれらのさらに上流に位置する伝達経路の関与を明確にする目的で、mTOR経路の上流因子として最近見いだされたhvps34と、これを調節することが示唆されているp150に着目した。ノックダウン効率の検討では、HEK293細胞において、hvps34のmRNAレベルは約30%に、タンパク質レベルは約40%に減少した。一方HepG2においても同程度のノックダウン効率を得ることができた。何れの細胞株においても、p150のmRNAは約30%に減少した。アミノ酸によるmTORの下流にあるp70S6キナーゼのリン酸化はhvps34とp150の何れのノックダウンよっても大きく減弱した。これらのことから、各細胞におけるアミノ酸シグナルの認識にvps34が関わっていることを明らかにし、認識機構の全貌解明に本実験系が有効であることが示された。一方、前年のDNAマイクロアレイによる解析で、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ(PEPCK)の遺伝子をアミノ酸欠乏に対する高応答遺伝子として見いだしたが、この遺伝子の上流域に既知のアミノ酸応答配列に類似した配列が存在することがわかった。この領域を含むレポーターベクターを作成し、転写因子ATF-3やATF-4と共発現させたところ、この領域がこれら因子によって強力な制御を受けていることが示された。このことから、PEPCKはこれまで用いてきたIGFBP-1同様にアミノ酸情報伝達を解析する上での有用なツールとして利用できることがわかった。

在我们去年的研究中，我们发现转录因子 ATF-4 和磷酸酶 PP1c 的敲低会减弱氨基酸信号转导。今年，为了阐明这些位于更上游的转导途径的参与，我们重点关注了 hvps34（最近发现它是 mTOR 途径的上游因子）和 p150（有人建议 p150 对其进行调节）。在检查敲低效率时，HEK293细胞中hvps34的mRNA水平降低至约30%，蛋白质水平降低至约40%。另一方面，HepG2 可以获得类似的敲低效率。在这两种细胞系中，p150 mRNA 减少至约 30%。通过敲低 hvps34 或 p150，mTOR 下游 p70S6 激酶的氨基酸磷酸化显着减弱。这些结果表明vps34参与每个细胞中氨基酸信号的识别，并证明该实验系统可以有效地阐明整个识别机制。另一方面，在前一年的DNA微阵列分析中，我们发现磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（PEPCK）基因是对氨基酸饥饿高度响应的基因，但在该基因的上游区域存在与已知氨基酸响应序列相似的序列。我发现确实如此。当我们创建包含该区域的报告载体并将其与转录因子 ATF-3 和 ATF-4 共表达时，我们表明该区域受到这些因子的强烈调控。这表明PEPCK与迄今为止已使用的IGFBP-1一样，可以用作分析氨基酸信息传递的有用工具。