脱ユビキチン化酵素の網羅的な基質同定法の開発

去泛素化酶综合底物鉴定方法的开发

基本信息

批准号：
18657040
负责人：
喜多村直実
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Tokyo Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

项目摘要

平成18年度に行った脱ユビキチン化酵素UBPYの網羅的な基質同定の解析により、基質候補蛋白質が多数同定された。これらのうちからUBPYと細胞内局在が一致する蛋白質の1つであるVAMP8を選び、実際にUBPYの基質であるかについて検討した。VAMP8をHeLa細胞に発現して解析したところ、VAMP8がユビキチン化を受けることがわかった。このユビキチン化レベルは、野生型UBPYの発現により減少し、酵素不活性型UBPYで増加した。またこのレベルはRNAi法を用いたUBPYのノックダウンにより増加した。これらの結果は、VAMP8が実際にUBPYの基質であることを示している。したがって網羅的なUBPYの基質同定法で同定された基質候補のうち少なくとも1つは実際に基質となっていることが明らかになった。今後は他の候補蛋白質についても解析し、網羅的な基質同定法が有効であるかをさらに検証していく必要がある。平成18年度に行った脱ユビキチン化酵素の網羅的な基質同定法が有効である可能性が高くなったので、この方法を他の脱ユビキチン化酵素USP36に応用した。その結果、360個の基質候補蛋白質が同定された。USP36の細胞内局在について解析したところ、USP36は核小体に局在した。したがってUSP36は核小体において脱ユビキチン化酵素として機能すると考えられることから、360個の候補蛋白質について核小体に局在するものを検索した。その結果、リボソーム蛋白質を含む60個の蛋白質が同定された。今後はこれらが実際にUSP36の基質であるかについて検証して行く必要がある。

通过对2006年进行的去泛素酶Ubpy的综合底物鉴定分析来鉴定大量候选底物蛋白。其中选择了ubpy的亚细胞定位的VAMP8，我们选择了其中一种，我们实际上研究了它是否是Ubpy的底物。当在HeLa细胞中表达VAMP8并进行分析时，发现VAMP8经历了泛素化。通过野生型Ubpy的表达降低了这种泛素化水平，并通过酶无效的Ubpy增加。使用RNAi方法敲除Ubpy也提高了此水平。这些结果表明VAMP8确实是Ubpy的底物。因此，已经揭示了至少由全面的Ubpy底物识别方法确定的底物候选者之一实际上是底物。将来，有必要分析其他候选蛋白，并进一步验证详尽的底物识别方法是否有效。由于在2006年进行的去泛素酶的全面底物鉴定方法可能是有效的，因此该方法应用于其他去泛素酶USP36。结果，确定了360个候选底物蛋白。当对USP36的亚细胞定位进行分析时，USP36定位于核仁。因此，USP36被认为是核仁中的去泛素酶，因此我们搜索了360个候选蛋白，这些蛋白质位于核仁。结果，鉴定了60种蛋白质，包括核糖体蛋白。将来，我们将需要调查这些实际上是USP36的底物。