脱ユビキチン化酵素の網羅的な基質同定法の開発

去泛素化酶综合底物鉴定方法的开发

基本信息

批准号：
18657040
负责人：
喜多村直実
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Tokyo Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

项目摘要

平成18年度に行った脱ユビキチン化酵素UBPYの網羅的な基質同定の解析により、基質候補蛋白質が多数同定された。これらのうちからUBPYと細胞内局在が一致する蛋白質の1つであるVAMP8を選び、実際にUBPYの基質であるかについて検討した。VAMP8をHeLa細胞に発現して解析したところ、VAMP8がユビキチン化を受けることがわかった。このユビキチン化レベルは、野生型UBPYの発現により減少し、酵素不活性型UBPYで増加した。またこのレベルはRNAi法を用いたUBPYのノックダウンにより増加した。これらの結果は、VAMP8が実際にUBPYの基質であることを示している。したがって網羅的なUBPYの基質同定法で同定された基質候補のうち少なくとも1つは実際に基質となっていることが明らかになった。今後は他の候補蛋白質についても解析し、網羅的な基質同定法が有効であるかをさらに検証していく必要がある。平成18年度に行った脱ユビキチン化酵素の網羅的な基質同定法が有効である可能性が高くなったので、この方法を他の脱ユビキチン化酵素USP36に応用した。その結果、360個の基質候補蛋白質が同定された。USP36の細胞内局在について解析したところ、USP36は核小体に局在した。したがってUSP36は核小体において脱ユビキチン化酵素として機能すると考えられることから、360個の候補蛋白質について核小体に局在するものを検索した。その結果、リボソーム蛋白質を含む60個の蛋白質が同定された。今後はこれらが実際にUSP36の基質であるかについて検証して行く必要がある。

2006 年对去泛素化酶 UBPY 进行的全面底物鉴定分析确定了许多候选底物蛋白。其中，我们选择了细胞内定位与UBPY相匹配的VAMP8蛋白，并研究了它是否实际上是UBPY的底物。当VAMP8在HeLa细胞中表达并分析时，发现VAMP8发生泛素化。野生型 UBPY 的表达会降低这种泛素化水平，而 UBPY 的酶失活形式会增加这种泛素化水平。使用 RNAi 方法敲低 UBPY 也可以提高该水平。这些结果表明VAMP8确实是UBPY的底物。因此，已经清楚的是，通过穷举UBPY底物鉴定方法鉴定的至少一种底物候选实际上是底物。未来还需要对其他候选蛋白进行分析，进一步验证综合底物鉴定方法是否有效。由于2006年进行的去泛素化酶的综合底物鉴定方法很可能是有效的，因此我们将该方法应用于另一种去泛素化酶USP36。结果，鉴定出 360 个底物候选蛋白。当分析USP36的细胞内定位时，USP36定位于核仁。因此，由于 USP36 被认为是核仁中的去泛素化酶，因此我们搜索了位于核仁中的 360 个候选蛋白。结果，鉴定出 60 种蛋白质，包括核糖体蛋白质。未来有必要验证这些是否确实是USP36的底物。