安定なRNA干渉を可能にするステーブル細胞株作製技術の開発

开发可实现稳定RNA干扰的稳定细胞系生产技术

基本信息

批准号：
17659111
负责人：
福重真一
金额：
$ 1.79万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17659111/
关键词：
発現制御遺伝子部位特異的組換え Cre RNA干渉

项目摘要

本研究ではCre-lox遺伝子挿入系を用い、ゲノム上の特定部位(前もって導入したlox部位)に二本鎖のsiRNAを発現するコンストラクトを正確に単一コピー挿入することによって、確実にRNA干渉をおこなう細胞株の作製を目的とした。本年度は、Ltk-細胞に単一コピーのlox位を含む細胞株、73-14を用い、マウスRet finger protein (RFP)に対するRNA干渉コンストラクトをCre-lox遺伝子挿入系により導入したステーブル細胞株を作製し、その効果を解析した。まず、73-14にRFPのRNA干渉コンストラクトを含むloxターゲティングベクターとCre発現プラスミドをトランスフェクションし、G418での薬剤選択により14個の組換え体を得た。これらの組換え体からゲノムDNAを抽出し、種々のPCRで組換え部位、RNA干渉コンストラクトの存在を確認した。次に、ネオマイシン耐性遺伝子をプローブとしてサザンハイブリダイゼーションをおこない、14クローンすべてがゲノム中のlox部位に正確にRFPのRNA干渉コンストラクトをもつことを確認した。さらに、ターゲティングベクター中のCMVプロモーターをプローブとしサザンハイブリダイゼーションをおこない、14クローン中、11クローンが単一コピーの組換え体であり、残り3クローンは2コピー以上の組換え体であることが判明した。ウエスタンブロティング法により14クローンのRFP干渉による蛋白レベルでの変化を解析した結果、どのクローンでも親株に比べ約50%のノックダウンが観察された。興味深いことにRNA干渉コンストラクトを2コピー以上もつ3個の組換え体でも単一コピーをもつ残り11個の組換え体とノックダウン率に大きな違いが見出せなかった。このことは、コピー数よりもRNA干渉を引き起こすshRNAの塩基配列を変える方がより効果的にRNA干渉をおこなえる可能性を示すと考えられる。

在这项研究中，我们使用CRE-LOX基因插入系统来创建细胞系，该细胞系可通过将表达双链siRNA的构建体的单个拷贝准确地插入基因组（预感染的落叶位点）上可靠地干扰RNA。在今年，我们使用了一个细胞系73-14，该细胞系在LTK细胞中包含LOX位置的单个副本来生成稳定的细胞系，其中使用CRE-LOX基因插入系统引入了小鼠RET手指蛋白（RFP）的RNA干扰构建线，并分析了此效果。首先，用含有RFP和CRE表达质粒的RNA干扰构建体的LOX靶向载体转染73-14，并通过使用G418的药物选择获得14个重组剂。从这些重组者中提取基因组DNA，各种PCR证实了重组位点和RNA干扰构建体的存在。接下来，使用新霉素耐药基因作为探针进行了南部杂交，以确认所有14个克隆在基因组的LOX位点都具有精确的RNA干扰构建体。此外，使用靶向载体中的CMV启动子作为探针进行了南部杂交，在14个克隆中，有11个克隆是重组剂的单个副本，其余的3个克隆是两个或更多的重组副本。通过蛋白质印迹分析了14个克隆的RFP干扰引起的蛋白质水平的变化，并且在所有克隆中都观察到与母体菌株相比，敲低约50％。有趣的是，我们发现其余11种重组因素与单个副本之间的敲低率没有显着差异，即使有两个或更多的RNA干扰构建体。这表明RNA干扰可能比改变shRNA的基本序列的拷贝数可能更有效，这会导致RNA干扰。