安定なRNA干渉を可能にするステーブル細胞株作製技術の開発

开发可实现稳定RNA干扰的稳定细胞系生产技术

基本信息

批准号：
17659111
负责人：
福重真一
金额：
$ 1.79万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17659111/
关键词：
発現制御遺伝子部位特異的組換え Cre RNA干渉

项目摘要

本研究ではCre-lox遺伝子挿入系を用い、ゲノム上の特定部位(前もって導入したlox部位)に二本鎖のsiRNAを発現するコンストラクトを正確に単一コピー挿入することによって、確実にRNA干渉をおこなう細胞株の作製を目的とした。本年度は、Ltk-細胞に単一コピーのlox位を含む細胞株、73-14を用い、マウスRet finger protein (RFP)に対するRNA干渉コンストラクトをCre-lox遺伝子挿入系により導入したステーブル細胞株を作製し、その効果を解析した。まず、73-14にRFPのRNA干渉コンストラクトを含むloxターゲティングベクターとCre発現プラスミドをトランスフェクションし、G418での薬剤選択により14個の組換え体を得た。これらの組換え体からゲノムDNAを抽出し、種々のPCRで組換え部位、RNA干渉コンストラクトの存在を確認した。次に、ネオマイシン耐性遺伝子をプローブとしてサザンハイブリダイゼーションをおこない、14クローンすべてがゲノム中のlox部位に正確にRFPのRNA干渉コンストラクトをもつことを確認した。さらに、ターゲティングベクター中のCMVプロモーターをプローブとしサザンハイブリダイゼーションをおこない、14クローン中、11クローンが単一コピーの組換え体であり、残り3クローンは2コピー以上の組換え体であることが判明した。ウエスタンブロティング法により14クローンのRFP干渉による蛋白レベルでの変化を解析した結果、どのクローンでも親株に比べ約50%のノックダウンが観察された。興味深いことにRNA干渉コンストラクトを2コピー以上もつ3個の組換え体でも単一コピーをもつ残り11個の組換え体とノックダウン率に大きな違いが見出せなかった。このことは、コピー数よりもRNA干渉を引き起こすshRNAの塩基配列を変える方がより効果的にRNA干渉をおこなえる可能性を示すと考えられる。

在本研究中，我们利用Cre-lox基因插入系统将表达双链siRNA的构建体的单拷贝精确插入到基因组上的特定位点（预先引入的lox位点），从而确保防止RNA干扰目的是为此目的创建细胞系。今年，我们使用 Ltk 细胞中含有单拷贝 lox 的细胞系 73-14 来开发稳定的细胞系，其中使用 Cre-lox 基因引入了针对小鼠 Ret 指蛋白 (RFP) 的 RNA 干扰构建体我们创建了它并分析了它的效果。首先用含有RFP RNA干扰构建体和Cre表达质粒的lox靶向载体转染73-14，并通过G418药物筛选获得14个重组体。从这些重组体中提取基因组 DNA，并使用各种 PCR 方法确认重组位点和 RNA 干扰构建体的存在。接下来，使用新霉素抗性基因作为探针进行Southern杂交，并证实所有14个克隆都在基因组中的lox位点精确地具有RFP RNA干扰构建体。此外，以打靶载体中的CMV启动子为探针进行Southern杂交，发现14个克隆中有11个是单拷贝重组体，其余3个克隆是2拷贝或更多拷贝。通过蛋白质印迹分析 14 个克隆中由于 RFP 干扰而导致的蛋白质水平的变化，结果发现与亲本菌株相比，在所有克隆中观察到约 50% 的敲低。有趣的是，与其余 11 个具有单拷贝的重组体相比，具有两个或更多拷贝 RNA 干扰构建体的 3 个重组体的敲低率没有显着差异。这表明，通过改变引起RNA干扰的shRNA的碱基序列，RNA干扰可能比改变拷贝数更有效。