二分子膜固定化ゲルの生体分子分析法への応用

双层膜固定凝胶在生物分子分析方法中的应用

基本信息

批准号：
17655071
负责人：
辻井薫
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

重合性界面活性剤イタコン酸ドデシルグリセリル(DGI : n-C_<12>H_<25>OCOCH_2C(=CH_2)COOCH_2CH(OH)一CH_20H)は、少量のイオン性界面活性剤の存在下で、サブミクロンの距離を隔てた規則的な二分子膜(ラメラ液晶)を形成し、可視光の回折によって発色するという面白い現象を示す。さらにアクリルアミド(AAm)、メチレンビスアクリルアミドが共存する水溶液中で重合することによって、二分子膜構遥を維持したままアクリルアミドゲル中に固定化できる。この二分子膜固定化ゲルは、世界中で当研究室にしか存在しないユニークな材料である。このユニークなゲルを、ゲル電気泳動基材として応用するのが本研究の目的である。上記の二分子膜固定化ゲルを基材として使用し、i)陰イオン性色素、ii)水溶性蛋白質、iii)膜蛋白質を対象サンプルとして、電気泳動による分離の検討を行った。比較として、既存の手法であるポリアクリルアミドゲル電気泳動法(PAGE)による分離の実験を、どのサンプルに対しても常に行った。低分子量の色素に対しては、二分子膜固定化ゲルによる電気泳動はPAGEと類似の分離挙動を示すが、移動度がやや遅い傾向が見られた。これは、二分子膜が存在することによって、サンプルの疎水性/親水性的性質が分離に働いた結果であると考えられる。本二分子膜固定化ゲルにおいては、ゲルの網目によるふるい効果以外にも別の分離機構が働いていることになり、興味深い。水溶性蛋白質の分離においては、二分子膜固定化ゲル中の移動度は常にPAGE中より速かった。この傾向は、固定化される二分子膜濃度が高くなる程顕著であった。この結果から、水溶性蛋白質は二分子膜中に取り込まれることなく、水相のみを移動しているのではないかと考えられる。二分子膜濃度が1.2〜1.6wt%程度で分離能が最もよくなり、2.0%を超えると分離せず、本手法として利用することは不可能であった。膜蛋白質をサンプルとした場合には、二分子膜固定化ゲル中を蛋白質は殆ど移動出来なかった。これは、膜蛋白質が二分子膜内に強く捕捉されるためではないかと考えられる。水溶性蛋白質の分離挙動との違いに着目すれば、水溶性蛋白質と膜蛋白質を分離する、新しい分離法が提案できたのではないかと思われる。

可聚合表面活性剂衣康酸十二烷基甘油酯（DGI：n-C_<12>H_<25>OCOCH_2C(=CH_2)COOCH_2CH(OH)-CH_20H）可在少量离子表面活性剂存在下形成规则的双层膜。（层状液晶）相隔的距离，并表现出一种有趣的现象，即它通过可见光的衍射而显色。此外，通过在丙烯酰胺(AAm)和亚甲基双丙烯酰胺共存的水溶液中聚合，可以将其固定在丙烯酰胺凝胶中，同时保持双层膜结构。这种双层膜固定凝胶是世界上仅存在于我们实验室的独特材料。本研究的目的是应用这种独特的凝胶作为凝胶电泳底物。使用上述双层膜固定化凝胶作为基质，研究了作为目标样品的i)阴离子染料、ii)水溶性蛋白质和iii)膜蛋白质的电泳分离。为了进行比较，始终对所有样品进行使用现有技术聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）的分离实验。对于低分子量染料，使用双层膜固定凝胶的电泳显示出与 PAGE 类似的分离行为，但迁移率往往稍慢。这被认为是由于双层膜的存在，样品的疏水/亲水特性作用于分离的结果。有趣的是，在这种双层膜固定凝胶中，除了凝胶网络的筛分作用之外，还有另一种分离机制在起作用。在水溶性蛋白质的分离中，双层固定凝胶的迁移率总是比 PAGE 更快。随着固定双层膜浓度的增加，这种趋势变得更加明显。根据该结果，认为水溶性蛋白质没有掺入双层膜中并且仅通过水相移动。当双层膜浓度为1.2～1.6wt％左右时，分离能力最佳，超过2.0％时，不会发生分离，无法使用该方法。当膜蛋白用作样品时，蛋白质几乎不能穿过双层膜固定化凝胶。这被认为是因为膜蛋白被双层膜强烈捕获。通过关注水溶性蛋白质分离行为的差异，似乎有可能提出一种分离水溶性蛋白质和膜蛋白的新分离方法。