T細胞活性化の一分子イメージング解析

T细胞激活的单分子成像分析

基本信息

批准号：
16659124
负责人：
斉藤隆
金额：
$ 2.24万
依托单位：
The Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

T細胞の抗原特異的な活性化において、活性化シグナルを伝達する重要な分子が集合して存在し、シグナル伝達の場であるlipid raftを可視化する目的で、lipid raft局在分子LATの細胞内ドメインをEGFPに置換したLAT-GFPを、アクチンプロモーターを用いて全身性に発現するトランスジェニックマウスを作製した。このLAT-GFPマウスではどの細胞もGFPを発現し、リンパ球もほとんどがGFP陽性であった。T細胞やマスト細胞では細胞表面とともに内部にもGFPが検出された。これら細胞由来のライセートを超遠心分画法で解析し、LAT-GFPはTriton不溶性のlipid raft分画に存在していることが判明した。この正常細胞に発現しているlipid raftを代表するLAT-GFPを2つの方法で解析した。(1)刺激をしない状態で、lipid raftに存在するGFPがどのような状態であるかを、リアルタイム蛍光一分子イメージング解析を行った。一分子レベルの解析では、LAT-GFPは非常に早い速度で細胞内外を入れ替わっていった。より解像度を下げると複数のGFP分子が同一の挙動をする基点を形成しており、raftの単位と考えられた。(2)人工的に作った脂質二重膜を用いたPlanar membraneのシステムを用いて、T細胞を活性化したときのLAT-GFPの動態を解析した。MHCクラスIIとICAM-1のGPI結合型分子を精製し、脂質二重膜に埋め込んだ膜上に、LAT-GFP発現T細胞を反応させて免疫シナプスを形成させると、一部のLAT-GFPがシナプス中心に集まったが、多くのLAT-GFPは凝集しないままであった。T細胞活性化にraftのシナプスへの凝集が必要でないことを示しているか、または、GM1で検出してきたlipid raftとの多様性を示している可能性も考えられた。

在T细胞的抗原特异性激活中，传递激活信号的重要分子以聚集体的形式存在，为了可视化作为信号传递部位的脂筏，我们研究了细胞内脂筏定位分子LAT。使用肌动蛋白启动子系统表达 LAT-GFP 的转基因小鼠，其结构域被 EGFP 取代。在这只 LAT-GFP 小鼠中，所有细胞都表达 GFP，并且大多数淋巴细胞呈 GFP 阳性。在T细胞和肥大细胞中，不仅在细胞表面而且在细胞内部也检测到了GFP。使用超速离心分级分析源自这些细胞的裂解物，发现LAT-GFP存在于Triton不溶性脂筏级分中。 LAT-GFP代表这些正常细胞中表达的脂筏，使用两种方法进行分析。 (1)进行实时荧光单分子成像分析来检查无刺激的脂筏中存在的GFP状态。单分子水平的分析表明，LAT-GFP在细胞内外以极快的速度进行交换。当分辨率降低时，多个GFP分子形成一个基点，其行为方式相同，并被认为是一个筏单元。 (2) 使用人工制造的脂质双层膜的平面膜系统，我们分析了 T 细胞激活时 LAT-GFP 的动态。当 MHC II 类和 ICAM-1 的 GPI 连接分子被纯化并嵌入脂质双层膜时，表达 LAT-GFP 的 T 细胞发生反应，形成聚集在突触中心的免疫突触，但仍保留大量 LAT-GFP。未聚合的。这可能表明 T 细胞激活不需要突触处的筏聚集，或者可能表明用 GM1 检测到的脂筏具有多样性。