単一細胞生物時計の検証:視交叉上核単独細胞培養による遺伝子発現と神経活動解析

单细胞生物钟验证：利用视交叉上核单细胞培养物进行基因表达和神经活动分析

基本信息

批准号：
16659058
负责人：
本間さと
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は、哺乳類の生物時計である視床下部視交叉上核の神経細胞が、他の細胞が全くない状態で、単一細胞でもリズム発振を行うかどうか、またもしリズム発振する細胞としない細胞とがある場合は、振動体として機能するための細胞数、細胞種を決定することを目的として行われた。そこで、野生型マウス・ラットの視交叉上核の培養系を用い、以下の実験を行った。1)マルチ電極を用いたリズム発振細胞の検出:新生ラット視交叉上核の低密度分散培養をマルチ電極アレイ上で行い、発火リズムを示す神経細胞のみの選択を試みた。しかし、細胞密度を通常の培養条件の1/10としたところで、全く自発発火を行う神経細胞の検出ができなくなった。視交叉上核神経細胞が安定的に自発発火を発振するには、高密度での培養が必須と考えられたため、時計遺伝子発現リズムの生物発光によるシングルセル解析に方法を変換した。2)時計遺伝子発現リズムの単一視交叉上核での解析:時計遺伝子Pealのプロモーター支配下にホタルルシフェラーゼを発現するPer1-Lucトランスジェニックマウスを用い、80〜100μmの厚さの視交叉上核スライスを作成し、培養用メンブレン上で気水界培養した。培地に基質ルシフェリンを添加し、デジタル冷却CCDカメラにて時計遺伝子Per1の発光画像を連続撮影した。その結果、SCNにおけるシングルセル発光解析が可能であり、かつ発光の検出できる細胞はすべて安定したper1発現リズムを示すことが明らかとなった。そこで、マイクロアイランド法にて、Per1-Lecマウス視交叉上核の低密度分散培養行い、単一神経の生者したアイランドの選択を行った。しかし、アイランドへの単一細胞の生着が確認できなかった。培養法の更なる改良は必須であるが、本研究結果は視交叉上核が高密度で初めて安定した振動を発揮する可能性を示唆している。

这项研究的目的是确定下丘脑视交叉上核（哺乳动物的生物钟）中的神经元是否在没有任何其他细胞的情况下即使在单个细胞中也会产生节律性振荡，以及细胞是否有节律性振荡。如果是这样，目的是确定作为振动体发挥作用所需的细胞数量和类型。因此，我们利用野生型小鼠和大鼠的视交叉上核培养系统进行了以下实验。 1)多电极检测节律振荡细胞：在多电极阵列上对新生大鼠视交叉上核进行低密度分散培养，并尝试仅选择表现出放电节律的神经元。然而，当细胞密度减少到正常培养条件的 1/10 时，就不可能检测到任何自发放电的神经元。由于人们认为高密度培养对于视交叉上核神经元稳定产生自发放电至关重要，因此该方法改为基于单细胞生物发光的时钟基因表达节律分析。 2）单个视交叉上核中时钟基因表达节律的分析：使用在时钟基因Peal的启动子控制下表达萤火虫荧光素酶的Per1-Luc转基因小鼠，使用厚度为80至100μm的视交叉上核制备切片并在空气和水中在培养膜上培养。将底物荧光素添加到培养基中，并使用数字冷却CCD相机连续拍摄时钟基因Per1的发光图像。结果表明，SCN 中的单细胞发光分析是可能的，并且所有可检测到发光的细胞都显示出稳定的 per1 表达节律。因此，我们采用微岛法对Per1-Lec小鼠的视交叉上核进行低密度分散培养，并选择含有活的单个神经元的岛。然而，无法证实单细胞在岛上的植入。尽管进一步改进培养方法是必要的，但本研究的结果表明视交叉上核可能首次在高密度下表现出稳定的振荡。