ウイルス増殖を制御する細胞性因子の新しいランダム同定法の確立

控制病毒增殖的细胞因子随机鉴定新方法的建立

基本信息

批准号：
16658137
负责人：
堀本泰介
金额：
$ 2.3万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

ウイルスの増殖は様々な細胞性因子により制御される。本研究では、インフルエンザウイルスをモデルに、これらの細胞性因子を網羅的に同定する新しい方法の確立を目的とする。それは、インフルエンザウイルスに感受性の細胞由来のcDNAライブラリーを組み込んだウイルスライブラリーを利用する方法である。つまり、組み換えウイルスが感染した細胞では、そのcDNA由来の蛋白質が発現し、それがウイルス増殖に必須であれば、組み換えウイルスは抵抗性細胞においても増殖する。したがって、組み換えウイルスライブラリーを様々な感染抵抗性細胞において解析すれば、ウイルス増殖を制御する細胞困子をランダムに同定できる。この作業仮説のもと、私たちは、GFPをレポーターとした組み換えウイルスシステムを検討した。その結果、HA/NAタンデムシステムと9本鎖ベクターシステムを確立した。前者は、本来のHA分節のHA遺伝子の下流にプロモーター配列を介してNA遺伝子をタンデムに挿入することにより、bicistoronicなHA分節を構築し、本来のNA分節のNA遺伝子の変わりに外来遺伝子を搭載するシステムである。後者は、HA分節のHA遺伝子の代わりにNA遺伝子を挿入したキメラ分節を構築し、本来のNA分節のNA遺伝子の変わりに外来遺伝子を搭載するシステムであり、つまりHA分節を2本もつような9本鎖ウイルスをレスキューするシステムである。いずれのシステムでもGFPレポーター遺伝子は比較的安定に維持されることがわかった。しかし、GFP遺伝子の代わりにcDNAを挿入した場合には、その分節が組換えウイルス中に安定して維持されないことが判明した。この欠点を補うために、他のベクターシステムの検討を行い、HA/NSタンデムシステムの構築に成功した。今後は、このシステムを本研究に応用する予定である。

病毒的生长受到多种细胞因素的控制。本研究旨在建立一种以流感病毒为模型全面识别这些细胞因子的新方法。这是一种利用病毒文库的方法，该病毒文库掺入了源自对流感病毒敏感的细胞的cDNA文库。换句话说，在被重组病毒感染的细胞中，来自cDNA的蛋白质被表达，如果这对于病毒增殖是必需的，那么重组病毒即使在耐药细胞中也会增殖。因此，通过分析各种抗感染细胞中的重组病毒文库，可以随机鉴定控制病毒增殖的细胞分子。基于这一工作假设，我们研究了使用 GFP 作为报告基因的重组病毒系统。结果，我们建立了HA/NA串联系统和9链载体系统。前者通过启动子序列将NA基因串联插入原HA片段中的HA基因下游，构建双顺反式HA片段，并携带外源基因代替原NA片段中的NA基因。那后者是构建嵌合片段的系统，其中插入NA基因来代替HA片段中的HA基因，并且加载外源基因来代替原始NA片段中的NA基因。拯救九链病毒的系统。我们发现 GFP 报告基因在两个系统中都保持相对稳定。然而，人们发现，当插入cDNA代替GFP基因时，该片段并不能稳定地保留在重组病毒中。为了弥补这一缺点，我们研究了其他载体系统并成功构建了HA/NS串联系统。未来，我们计划将该系统应用到这项研究中。