ARFおよびARLの活性化定量法および細胞内局在決定法の開発

ARF和ARL激活定量方法和细胞内定位方法的开发

基本信息

批准号：
16657059
负责人：
中山和久
金额：
$ 2.3万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16657059/
关键词：
GGA ARF X線結晶構造解析小胞輸送 ARF-GEF アダプター GATドメイン BIG2

项目摘要

低分子量GTP結合蛋白質ARFは、オルガネラ間の蛋白質輸送を行う輸送小胞の形成を調節する。哺乳動物には6種類のアイソフォーム(ARF1-ARF6)が存在する。細胞質に不活性なGDP結合型で存在するARFは、グアニンヌクレオチド交換因子(ARF-GEF)により活性を有するGTP型になるとオルガネラ膜に結合する。その部位にCOPIやAP-1などのコート蛋白質複合体が結合して輸送小胞の形成が始まる。次に、形成された輸送小胞上のGTP型ARFにGTPase活性化蛋白質(ARF-GAP)が作用してGTPがGDPへと加水分解され、ARFとともにコート蛋白質が小胞膜から遊離する。この裸の輸送小胞が標的オルガネラ膜に融合し、蛋白質輸送が完了する。つまり、細胞内小胞輸送はARF-GEFによるARFのGTP型への変換とARF-GAPによるGDP型への変換により調節されている。最近、ARFと結合して小胞輸送を調節する蛋白質GGAを同定し、GGA分子の中央にあるGATドメインがGTP結合型ARFとの特異的な結合に関与することを示した。そこで本研究では、この相互作用を利用して以下のことを明らかにした。1.GSTと融合させたGATドメインを用いて、細胞内の活性型ARFを定量するプル・ダウンアッセイ系を確立した。2.ARF-GEFの一種であるBIG2を細胞内で発現させた時に、どのARFのアイソフォームを活性化するのかをこのアッセイ系を用いて調べたところ、ARF1とARF3を活性化し、ARF5やARF6を活性化しないことを証明した。

ARF 是一种小型 GTP 结合蛋白，可调节在细胞器之间运输蛋白质的运输囊泡的形成。哺乳动物中有六种亚型（ARF1-ARF6）。 ARF 以非活性 GDP 结合形式存在于细胞质中，当通过鸟嘌呤核苷酸交换因子 (ARF-GEF) 转化为活性 GTP 形式时，与细胞器膜结合。 COPI 和 AP-1 等外壳蛋白复合物与该位点结合，并开始形成转运囊泡。接下来，GTP酶激活蛋白（ARF-GAP）作用于形成的转运囊泡上的GTP型ARF，将GTP水解为GDP，外壳蛋白与ARF一起从囊泡膜上释放出来。这种裸露的运输囊泡与目标细胞器膜融合，完成蛋白质运输。换句话说，细胞内囊泡运输是通过ARF-GEF将ARF转化为GTP型以及ARF-GAP将ARF转化为GDP型来调节的。最近，我们鉴定了GGA，一种与ARF结合并调节囊泡运输的蛋白质，并表明GGA分子中心的GAT结构域参与与GTP结合的ARF的特异性结合。在本研究中，我们利用这种相互作用来阐明以下内容。 1. 我们建立了一个 Pull-down 测定系统，使用与 GST 融合的 GAT 结构域来量化细胞中的活性 ARF。 2.当我们使用该检测系统来研究当BIG2（一种ARF-GEF）在细胞中表达时，哪些ARF异构体被激活时，我们发现它激活了ARF1和ARF3，并激活了ARF5和ARF6。不激活。