In vivo RNAiによる遺伝子ノックダウンマウス作出と薬物動態研究への応用

通过体内RNAi创建基因敲除小鼠及其在药代动力学研究中的应用

基本信息

批准号：
15659036
负责人：
高倉喜信
金额：
$ 1.79万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

2本鎖RNAを用いた特定遺伝子の発現抑制は、RNA干渉(RNA interference:以下RNAi)と呼ばれるが、線虫において最初に報告され、効率よく配列特異的な遺伝子のノックダウンが可能であることが示された。その後、改良法の適用によりRNAiの誘導が培養哺乳類細胞においても可能であることが発見され、極めて有用性の高い遺伝子機能解析ツールとしてにわかに注目を集めている。本研究は、RNAiをマウス個体レベルで実現する方法を確立し、薬物動態を支配する重要な機能分子であるトランスポーターや薬物代謝酵素の遺伝子をin vivoでノックダウンしたマウスの作出を目指す。昨年度はホタルルシフェラーゼを外来のモデル標的遺伝子に選択してRNAiの評価を行ない、マウスの系において水溶液の形で高容量(1.6ml/mouse)、高速(5秒以内)で静脈内投与するハイドロダイナミクス法を利用することで、in vivoで外来遺伝子のノックダウンが可能であることを明らかにした。そこで本年度は、内因性の標的遺伝子標的として肝実質細胞に発現している薬物排出トランスポーターP-Glycoprotein (P-gp)を選択し、標的塩基配列に相補的な合成の短い二本鎖RNA(siRNA)およびsiRNA発現プラスミドベクターを設計した。これらをマウス静脈内にハイドロダイナミクス法により投与した結果、mRNAレベルが有意に低下することが明らかとなった。また、ウエスタンブロッティングによるタンパクレベルでの評価においても低下していることが示され、in vivoにおける内因性の標的遺伝子をノックダウンできる可能性が示唆された。

2。使用链RNA抑制特定基因的表达称为RNA干扰（RNAi）。后来，已经发现了改进定律的应用，即RNAi的指导在培养的哺乳动物中也是可能的，并且一直在吸引人们作为一种非常有用的遗传功能分析工具。这项研究建立了一种在小鼠个体水平上实现RNAi的方法，并旨在创建一种在体内被击倒的小鼠，该小鼠是一种转运蛋白和药物代谢酶基因，这是控制药代动力学的重要功能分子。去年，萤火虫荧光素酶被选为门诊模型靶基因，以评估RNAi，在小鼠系统中，高容量（1.6 mL/鼠标）以水溶液的形式高速度（在5秒钟内）水域的形式。动力学的使用表明，体内可以击倒门诊基因。因此，在这个财政年度中，选择了在肝脏真实细胞中以靶向内源性基因靶标表示的药物发射转运蛋白P-糖蛋白（P-gp），并进行了短的双链RNA（与之补充（对靶基序列）和siRNA表达质粒载体。在小鼠静脉中的水力动力学方法的给药表明，mRNA水平显着降低。此外，还表明，通过蛋白质水平的评估也被拒绝，这表明在体内击倒靶基因的可能性。