パーツ並べ変え蛋白質のX線解析による新しいバイオインフォマティクス基盤の確立

利用部分重排蛋白质的 X 射线分析建立新的生物信息学平台

• 批准号: 15657036
• 负责人: 片柳 克夫
• 金额: $ 1.92万
• 依托单位: Hiroshima University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15657036/
• 关键词: X線構造解析; パーツ並べ替えタンパク質; モルテングロビュール状態; アンフィンセンのドグマ; 進化分子工学; タンパク質構造構築原理; 構造ゲノム科学; 超高分解能結晶; X線構造解析; パーツ並べ替えタンパク質; モルテングロビュール状態; アンフィンセンのドグマ; 進化分子工学; タンパク質構造構築原理; 構造ゲノム科学; 超高分解能結晶

本研究では,タンパク質の二次構造単位領域(パーツ)でポリペプチド鎖を入れ替えたタンパク質の結晶構造を世界に先駆けて解明した。柳川が以前バルナーゼについて,二次構造(Sシリーズ)とモジュール(Mシリーズ)の観点からそれぞれ6つのパーツにわけ,すべての組み合わせに対するパーツ並べ替えタンパク質46種類を作成した中から,比較的立体構造や活性を持っているS2543とS2354H102A(S2354は構造が取れなくH102A変異体にして構造をとったもの)について,大腸菌系における大量培養・精製,結晶化,構造解析を行った。S2543についてはANSを用いた蛍光実験からモルテングロビュール状態と考えられていたが,我々は1.5Åを超える高分解能の結晶を得,さらに放射光実験で1.1Å超高分解能でのデータ収集に成功した。しかし重原子同型置換法による構造解析の結果,全長110アミノ酸残基に対し約10残基の電子密度の観測不可能な部分があった。これが揺らぎによるものか否かを決定付けるために,2年目は基質アナログである2'3'GMPとの複合体の結晶化・構造解析にも成功した。その結果,S2354は超遠心の実験から2量体と示唆されていたが,結晶構造でもC端側がDomain swapした2量体であった。ただし基質GMP有無で会合構造が大きく異なることがわかった。GMPS2354の場合はS2543よりさらに不安定で濃縮が困難であったが,改良を重ねた結果高濃度濃縮に成功し,微結晶析出までこぎつけた。いずれにせよ,これだけ大胆に1次配列を変えたにもかかわらず超高分解能での詳細構造が得られたことは,現在の構造ゲノム科学を支えるアンフィンセンのドグマに反する立体構造を詳細に解き明かしたことであり,進化分子工学やタンパク質構造構築原理などのバイオインフォマティクスに多大な貢献が期待できる結果である(論文作成中)。

在这项研究中，我们首先阐明了在蛋白质的二级结构单位区域（部分）中取代多肽链的晶体结构。 Yanagawa previously divided into six parts from the perspective of secondary structure (S series) and module (M series) and created 46 types of part sorting proteins for all combinations, and produced S2543 and S2354H102A (S2354 was a structure that was not possible and was a H102A mutant that had no structure, and was used as a structure), and mass culture, purification, crystallization, and structural analysis in大肠杆菌系统。尽管使用ANS认为S2543被认为是荧光实验中的MortenGroubur态，但我们获得了高分辨率超过1.5Å的晶体，并且在同步辐射实验中以1.1Å的超高分辨率以1.1Å的方式成功收集了数据。然而，使用重原子同构替代方法的结构分析表明，有一个不可观察的部分，电子密度约为10个残基，总长度为110个氨基酸残基。为了确定这是否是由于波动的原因，我们还成功地分析了第二年与底物类似物2'3'GMP对复合物的结晶和结构分析。结果表明，S2354是超速离心实验的二聚体，但是在晶体结构中，它也是二聚体在C端侧的二聚体。但是，发现关联结构取决于底物GMP的存在或不存在。在GMPS2354的情况下，它甚至比S2543更不稳定并且难以集中，但是由于反复改进，浓度被成功浓缩，甚至达到了微晶沉淀。在任何情况下，尽管对主要序列进行了如此大胆的变化，但仍获得了超高分辨率的详细结构，这是对三维结构的详细解释，这与Anfinsen的教条相反，该结构支持当前的结构性基因组科学，并且可以极大地促进生物培养的结构，例如制备了诸如进化的蛋白质构造和蛋白质的蛋白质。