膜蛋白質3次元結晶の電気特性測定法の開発

三维膜蛋白晶体电特性测量方法的开发

基本信息

批准号：
13878133
负责人：
清水啓史
金额：
$ 0.38万
依托单位：
福井医科大学
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-13878133/
关键词：
結晶電気特性イオンチャネル電気特性測定

项目摘要

結晶状態と単分子との電気特性の違いを測定するのに有用なK^+チャネル(KcsA)を用いて研究を行った。1.二次元結晶、三次元結晶の作製大腸菌でのKcsAの大量発現系を確立した。また、大量培養から、大量精製を行い結晶化に必要な高純度のサンプルを大量に得ることができた。このサンプルを用い、結晶化条件を探索したところ、脂質二重膜中でKcsAが並び、重層した形の三次元微結晶を得ることに成功した。脂質二重膜中に埋まった状態で三次元結晶になっているため、電気特性の測定には非常に有用な結晶である。現在、より大きな結晶を得るための結晶化条件を探索中である。2.結晶の電位測定装置の開発ガラス電極の先端に結晶を含んだ脂質二重膜を張る方法について検討した。電極の材質と脂質組成を検討し、電流の漏れが少なく、電極自身の電気特性のよい組み合わせを決定した。現在、その電極と脂質膜の組み合わせを用いて、KcsAの単分子電気特性の測定を行っている。得られた電極と脂質膜の組み合わせは、非常に安定な二重膜を形成するため、精緻な単分子電気特性が明らかになりつつある。3.蛍光ラベルした結晶を用いた蛍光測定KcsAのCys変異体を作製し、大量培養、大量精製を行った。現在、単分子電気特性の測定と組み合わせて、構造変化を検出する適当な蛍光物質を検討中である。また、他のSH修飾剤と電気特性の測定を組み合わせることによって、Cys変異を導入する最適部位を探索中である。

该研究是使用K^+通道（KCSA）进行的，这对于测量晶体状态和单分子之间的电性能差异很有用。 1。制备2D和3D晶体在大肠杆菌中建立了KCSA的大规模表达系统。此外，从大量培养物中获得了大量的纯化，以获得大量的结晶所需的高纯度样品。使用此样品，我们搜索了结晶条件，发现KCSA排列在脂质双层中，并获得了三维微晶，以获得分层形式。由于将其埋在脂质双层中时是三维晶体，因此它是测量电性能的非常有用的晶体。当前，我们正在寻找结晶条件以获得较大的晶体。 2。开发晶体势测量装置，我们研究了一种将含有晶体含有晶体的脂质双层膜放置在玻璃电极尖端的方法。检查了电极的材料和脂质组成，并确定电极本身的组合，几乎没有电流泄漏和电性能的良好组合。当前，使用电极和脂质膜的组合测量KCSA的单分子电性能。电极和脂质膜的组合形成非常稳定的双层膜，精确的单分子电性能变得越来越明显。 3。使用荧光标记的晶体进行荧光测量，制备了KCSA的Cys突变体，并通过质量培养和纯化。目前，正在研究适当的荧光材料，以检测结构变化与单分子电性能的测量。此外，通过将其他SH修饰符与电气性能测量相结合，正在搜索引入CYS突变的最佳位点。