膜蛋白質3次元結晶の電気特性測定法の開発

三维膜蛋白晶体电特性测量方法的开发

基本信息

批准号：
13878133
负责人：
清水啓史
金额：
$ 0.38万
依托单位：
福井医科大学
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-13878133/
关键词：
結晶電気特性イオンチャネル電気特性測定

项目摘要

結晶状態と単分子との電気特性の違いを測定するのに有用なK^+チャネル(KcsA)を用いて研究を行った。1.二次元結晶、三次元結晶の作製大腸菌でのKcsAの大量発現系を確立した。また、大量培養から、大量精製を行い結晶化に必要な高純度のサンプルを大量に得ることができた。このサンプルを用い、結晶化条件を探索したところ、脂質二重膜中でKcsAが並び、重層した形の三次元微結晶を得ることに成功した。脂質二重膜中に埋まった状態で三次元結晶になっているため、電気特性の測定には非常に有用な結晶である。現在、より大きな結晶を得るための結晶化条件を探索中である。2.結晶の電位測定装置の開発ガラス電極の先端に結晶を含んだ脂質二重膜を張る方法について検討した。電極の材質と脂質組成を検討し、電流の漏れが少なく、電極自身の電気特性のよい組み合わせを決定した。現在、その電極と脂質膜の組み合わせを用いて、KcsAの単分子電気特性の測定を行っている。得られた電極と脂質膜の組み合わせは、非常に安定な二重膜を形成するため、精緻な単分子電気特性が明らかになりつつある。3.蛍光ラベルした結晶を用いた蛍光測定KcsAのCys変異体を作製し、大量培養、大量精製を行った。現在、単分子電気特性の測定と組み合わせて、構造変化を検出する適当な蛍光物質を検討中である。また、他のSH修飾剤と電気特性の測定を組み合わせることによって、Cys変異を導入する最適部位を探索中である。

我们使用 K^+ 通道 (KcsA) 进行了研究，该通道对于测量晶态和单分子之间的电特性差异非常有用。 1.二维和三维晶体的制备我们建立了KcsA在大肠杆菌中的大规模表达系统。此外，通过大规模培养，我们能够进行大规模纯化并获得结晶所需的大量高纯度样品。使用该样品，我们探索了结晶条件，并成功获得了 KcsA 在脂质双层中排列和分层的三维微晶体。由于它是嵌入脂质双层膜中的三维晶体，因此它是用于测量电特性的极其有用的晶体。目前，我们正在寻找结晶条件以获得更大的晶体。 2. 开发用于测量晶体电位的装置我们研究了一种将含有晶体的脂质双层附着到玻璃电极尖端的方法。我们研究了电极的材料和脂质成分，并确定了一种具有低电流泄漏和电极本身良好电性能的组合。我们目前正在使用电极和脂质膜的组合来测量 KcsA 的单分子电特性。由此产生的电极和脂质膜的组合形成了极其稳定的双膜，并且单分子的精确电特性变得清晰。 3.使用荧光标记晶体的荧光测量我们创建了KcsA的Cys突变体，大量培养它，并大量纯化它。我们目前正在研究合适的荧光材料，用于结合单分子电特性的测量来检测结构变化。我们还在通过结合其他 SH 修饰剂和电特性测量来寻找引入 Cys 突变的最佳位点。