細胞質蛋白による異物排出トランスポーター局在調節機構の解析

细胞质蛋白异物外排转运蛋白定位调控机制分析

基本信息

批准号：
13877393
负责人：
鈴木洋史
金额：
$ 0.32万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

我々は、本年度科学研究費補助金(特定領域研究)の援助を受け、apical側膜上に発現されるbreast cancer resistance protein (BCRP/ABCG2)が硫酸抱合体を選択的に輸送し、異物排出に重要な役割を果たすことを示してきた。この蛋白質が正常に機能するためにはapical膜へ正常に局在することが必要である。本萌芽研究では、BCRPがapical側膜に局在する機構について検討を加えた。この目的のために、BCRP cDNAを安定発現させたLLC-PK1細胞を用いた。特にこの蛋白はN末端側に、ヌクレオチド結合ドメインを含む長い細胞質ドメインを有するため、N末のdeletion mutantを作成して局在の変化を共焦点レーザー顕微鏡により観察した。N末から10個ずつのアミノ酸を削り、局在を観察したところ、30個までのアミノ酸を欠損させても影響はないものの、40個、50個、および60個のアミノ酸を欠損させると細胞内に局在することが示された。なお、ヌクレオチド結合ドメインは、N末から60番目以降に存在している。そこで、30個めから40個めまでのアミノ酸を2個ずつ欠損させて検討したところ、34個まで削っても正常な局在を示すのに対し、36個以上削ると細胞内にも局在することが示された。この領域はヒト、マウス、ブタのBCRPで保存性の高い領域であり、この領域に何らかの細胞質蛋白質が相互作用して、BCRPのapical局在を支持しているものと推察された。

在今年的科学研究资助金（特定领域研究）的支持下，我们证明了在顶膜上表达的乳腺癌抗性蛋白（BCRP/ABCG2）可以选择性地转运硫酸盐缀合物并抑制异物已经证明它发挥着重要作用。为了使这种蛋白质正常发挥作用，它必须定位于顶膜。在这项初步研究中，我们研究了 BCRP 定位于顶侧膜的机制。为此，使用稳定表达 BCRP cDNA 的 LLC-PK1 细胞。特别是，由于该蛋白质具有长的胞质结构域，在 N 末端含有核苷酸结合结构域，因此我们创建了 N 末端缺失突变体，并使用共聚焦激光显微镜观察了定位的变化。当我们从N端去除10个氨基酸并观察它们的定位时，我们发现虽然删除最多30个氨基酸没有影响，但删除40、50和60个氨基酸引起的细胞内显示定位于请注意，核苷酸结合结构域存在于从 N 末端算起的第 60 个位置之后。因此，当我们删除第30到40个氨基酸中的两个氨基酸时，我们发现即使我们删除了最多34个氨基酸，也观察到正常定位，但是当我们删除36个或更多氨基酸时，定位也定位在结果表明。该区域在人类、小鼠和猪的 BCRP 中高度保守，推测某些细胞质蛋白与该区域相互作用以支持 BCRP 的顶端定位。