細胞質蛋白による異物排出トランスポーター局在調節機構の解析

细胞质蛋白异物外排转运蛋白定位调控机制分析

基本信息

批准号：
13877393
负责人：
鈴木洋史
金额：
$ 0.32万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

我々は、本年度科学研究費補助金(特定領域研究)の援助を受け、apical側膜上に発現されるbreast cancer resistance protein (BCRP/ABCG2)が硫酸抱合体を選択的に輸送し、異物排出に重要な役割を果たすことを示してきた。この蛋白質が正常に機能するためにはapical膜へ正常に局在することが必要である。本萌芽研究では、BCRPがapical側膜に局在する機構について検討を加えた。この目的のために、BCRP cDNAを安定発現させたLLC-PK1細胞を用いた。特にこの蛋白はN末端側に、ヌクレオチド結合ドメインを含む長い細胞質ドメインを有するため、N末のdeletion mutantを作成して局在の変化を共焦点レーザー顕微鏡により観察した。N末から10個ずつのアミノ酸を削り、局在を観察したところ、30個までのアミノ酸を欠損させても影響はないものの、40個、50個、および60個のアミノ酸を欠損させると細胞内に局在することが示された。なお、ヌクレオチド結合ドメインは、N末から60番目以降に存在している。そこで、30個めから40個めまでのアミノ酸を2個ずつ欠損させて検討したところ、34個まで削っても正常な局在を示すのに対し、36個以上削ると細胞内にも局在することが示された。この領域はヒト、マウス、ブタのBCRPで保存性の高い領域であり、この領域に何らかの細胞質蛋白質が相互作用して、BCRPのapical局在を支持しているものと推察された。

在今年对科学研究的赠款（特定领域研究）的支持下，我们表明乳腺癌抗性蛋白（BCRP/ABCG2）在根尖膜上表达，有选择地运输硫酸盐缀合物，并在外国物质排泄中起重要作用。为了使该蛋白质正常起作用，必须正常定位在顶端膜上。在这项胚胎研究中，我们研究了BCRP位于顶端膜的机制。为此，使用了稳定表达BCRP cDNA的LLC-PK1细胞。特别是，由于该蛋白具有较长的细胞质结构域（包含核苷酸结合结构域），因此创建了N末端缺失突变体，并通过共聚焦激光显微镜观察到定位的变化。当从N末端去除10个氨基酸并观察到定位时，表明多达30个氨基酸的缺乏没有作用，但是缺乏40、50和60个氨基酸会导致细胞内定位。核苷酸结合结构域存在于N末端的第60位。因此，当我们研究两个氨基酸（从30到40）时，我们发现即使剃光至34个氨基酸，也发现该定位是正常的，而当剃须36以上时，它也位于细胞中。该区域是人，小鼠和猪BCRP中高度保守的区域，据估计，某些细胞质蛋白与该区域相互作用，支持BCRP的顶端定位。